Los investigadores han desarrollado una nueva técnica de imágenes de ADN mejorada que puede sondear la estructura de hebras de ADN individuales a nanoescala. Dado que el ADN es la raíz de muchos procesos patológicos, la técnica podría ayudar a los científicos a obtener información importante sobre lo que falla cuando el ADN se daña o cuando otros procesos celulares afectan la expresión génica.

El nuevo método de obtención de imágenes se basa en una técnica llamada microscopía de molécula única al agregar información sobre la orientación y el movimiento de los tintes fluorescentes adheridos a la hebra de ADN.

W. E. Moerner, Universidad Stanford, ESTADOS UNIDOS, es el fundador de la espectroscopia de molécula única, un método revolucionario de 1989 que permitió a los científicos visualizar moléculas individuales con microscopía óptica por primera vez. De los premios Nobel de 2014 por microscopía óptica más allá del límite de difracción (Moerner, Infierno y Betzig), Moerner y Betzig utilizaron moléculas individuales para obtener imágenes de una densa matriz de moléculas en diferentes momentos.

En la revista de The Optical Society para investigaciones de alto impacto, Optica , el equipo de investigación dirigido por Moerner describe su nueva técnica y la demuestra obteniendo imágenes de superresolución y medidas de orientación para miles de moléculas de colorante fluorescente unidas a cadenas de ADN.

"Puede pensar en estas nuevas medidas como pequeñas flechas de dos puntas que muestran la orientación de las moléculas unidas a lo largo de la cadena de ADN, ", dijo Moerner." Esta información de orientación informa sobre la estructura local de las bases del ADN porque restringen la molécula. Si no tuviéramos esta información de orientación, la imagen sería solo un punto ".

Añadiendo más información a nanoescala

Una hebra de ADN es muy larga, pero cuerda estrecha, solo unos pocos nanómetros de ancho. Microscopía de molécula única, junto con tintes fluorescentes que se adhieren al ADN, se puede utilizar para visualizar mejor esta pequeña cuerda. Hasta ahora, era difícil entender cómo se orientaban esos tintes e imposible saber si el tinte fluorescente estaba adherido al ADN de forma rígida o algo suelta.

Adam S. Backer, primer autor del artículo, desarrolló una forma bastante simple de obtener orientación y dinámica de rotación de miles de moléculas individuales en paralelo. "Nuestra nueva técnica de imágenes examina cómo se alinea cada molécula de tinte individual que marca el ADN en relación con la estructura mucho más grande del ADN, ", dijo Backer." También estamos midiendo qué tan inestable es cada una de estas moléculas, que nos puede decir si esta molécula está atascada en una alineación particular o si se mueve en el transcurso de nuestra secuencia de medición ".

La nueva técnica ofrece información más detallada que los métodos de "conjunto" de hoy en día, que promedian las orientaciones de un grupo de moléculas, y es mucho más rápido que las técnicas de microscopía confocal, que analizan una molécula a la vez. El nuevo método incluso se puede utilizar para moléculas que son relativamente tenues.

Debido a que la técnica proporciona información a nanoescala sobre el ADN en sí, podría ser útil para monitorear cambios en la conformación del ADN o daño a una región particular del ADN, que aparecería como cambios en la orientación de las moléculas de tinte. También podría usarse para monitorear las interacciones entre el ADN y las proteínas, que impulsan muchos procesos celulares.

30, 000 orientaciones de una sola molécula

Los investigadores probaron la técnica de obtención de imágenes de ADN mejorada usándola para analizar un tinte intercalante; un tipo de tinte fluorescente que se desliza en las áreas entre las bases del ADN. En un experimento de imagen típico, adquieren hasta 300, 000 ubicaciones de una sola molécula y 30, 000 mediciones de orientación de una sola molécula en poco más de 13 minutos. El análisis mostró que las moléculas de colorante individuales estaban orientadas perpendicularmente al eje de la hebra de ADN y que, si bien las moléculas tendían a orientarse en esta dirección perpendicular, también se movían dentro de un cono restringido.

A continuación, los investigadores realizaron un análisis similar utilizando un tipo diferente de tinte fluorescente que consta de dos partes:una parte que se adhiere al lado del ADN y una parte fluorescente que se conecta a través de una atadura flexible. La técnica de imágenes de ADN mejorada detectó esta laxitud, mostrando que el método podría ser útil para ayudar a los científicos a comprender, molécula por molécula, si diferentes etiquetas se adhieren al ADN de forma móvil o fija.

En el papel, los investigadores demostraron una resolución espacial de alrededor de 25 nanómetros y mediciones de orientación de una sola molécula con una precisión de alrededor de 5 grados. También midieron la dinámica de rotación, o flacidez, de moléculas individuales con una precisión de unos 20 grados.

Cómo funciona

Para adquirir información de orientación de una sola molécula, los investigadores utilizaron una técnica bien estudiada que agrega un elemento óptico llamado modulador electroóptico al microscopio de una sola molécula. Para cada fotograma de la cámara, este dispositivo cambió la polarización de la luz láser utilizada para iluminar todos los tintes fluorescentes.

Since fluorescent dye molecules with orientations most closely aligned with the laser light's polarization will appear brightest, measuring the brightness of each molecule in each camera frame allowed the researchers to quantify orientation and rotational dynamics on a molecule-by-molecule basis. Molecules that switched between bright and dark in sequential frames were rigidly constrained at a particular orientation while those that appeared bright for sequential frames were not rigidly holding their orientation.

"If someone has a single-molecule microscope, they can perform our technique pretty easily by adding the electro-optic modulator, " said Backer. "We've used fairly standard tools in a slightly different way and analyzed the data in a new way to gain additional biological and physical insight."