Las membranas celulares están formadas por fosfolípidos y proteínas unidas o incrustadas. Las proteínas de membrana desempeñan funciones vitales en el metabolismo y la vida de la célula. No puede utilizar la microscopía ordinaria para visualizar o caracterizar proteínas de adhesión, proteínas de transporte y canales de proteínas en la membrana celular. El uso de microscopía electrónica y una técnica llamada "fractura por congelación", que divide las membranas celulares congeladas, permite la visualización de la estructura de la membrana y la organización de proteínas dentro del mar de fosfolípidos. La combinación de otros métodos con la fractura por congelación no solo nos ayuda a comprender la estructura de diferentes membranas celulares y proteínas de membrana, sino que también permite la visualización y el análisis detallado de la función de proteínas, bacterias y virus específicos.
Basic Steps in Freeze Fracture
Usando nitrógeno líquido, muestras de tejido biológico o células se congelan rápidamente para inmovilizar los componentes celulares. Las membranas celulares están compuestas por dos capas de fosfolípidos, llamadas bicapas, donde las colas lipídicas hidrófobas o que odian el agua apuntan hacia el interior de la membrana y las puntas hidrófilas o hidrófilas de la molécula lipídica apuntan hacia afuera y hacia El interior de la celda. La muestra congelada se agrieta o se fractura con un microtomo, que es un instrumento similar a un cuchillo para cortar cortes finos de tejido. Esto hace que la membrana celular se separe precisamente entre las dos capas porque la atracción entre las colas lipídicas hidrófobas representa el punto más débil. Después de la fractura, la muestra se somete a un procedimiento de vacío, llamado "grabado por congelación". La superficie de la muestra fracturada está sombreada con carbono y vapor de platino para hacer una réplica estable, que sigue los contornos del plano de fractura. El ácido se utiliza para digerir el material orgánico que se adhiere a la réplica, dejando una capa delgada de platino de la superficie de la membrana fracturada. Luego, esta capa se analiza mediante microscopía electrónica.
Freeze Etching
El grabado por congelación es el secado al vacío de una muestra biológica no fijada, congelada y fracturada por congelación. El procedimiento de secado al vacío es similar al secado por congelación de frutas y verduras que se envasan y venden en las tiendas de comestibles. Sin el grabado por congelación, muchos detalles de la estructura celular están ocultos por los cristales de hielo. El paso de grabado profundo o por congelación mejora y extiende el método de fractura por congelación original, permitiendo la observación de las membranas celulares durante varias actividades. Permite el análisis no solo de la estructura de la membrana, sino también de los componentes intracelulares y proporciona información estructural detallada sobre bacterias, virus y grandes complejos de proteínas celulares.
Sciencing Video Vault
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Microscopía electrónica
La microscopía electrónica puede revelar y ampliar más de un millón de veces los organismos o estructuras más pequeños, como bacterias, virus, componentes intracelulares e incluso las proteínas. La visualización se crea bombardeando una muestra ultrafina con un haz de electrones. Los dos métodos de microscopía electrónica son la microscopía electrónica de barrido, o SEM, y la microscopía electrónica de transmisión, o TEM. Las muestras de fracturas por congelación se analizan rutinariamente con TEM. TEM tiene mejor resolución que SEM y ofrece información estructural de hasta 3 nanómetros de réplicas.
Revelación de la estructura de la membrana celular.
El desarrollo y uso de la microscopía electrónica de fractura por congelación mostró que las membranas plasmáticas están compuestas por bicapas lipídicas y aclaró cómo se organizan las proteínas dentro de las membranas celulares. La fractura por congelación da una apariencia única al interior de las membranas celulares, ya que divide y separa los fosfolípidos de membrana en dos hojas o caras opuestas y complementarias. En los más de 50 años desde la introducción de la primera máquina de fractura por congelación, hacer una réplica de platino sigue siendo la única forma de obtener información estructural sobre la membrana celular. La técnica muestra si las proteínas específicas flotan o están ancladas en la membrana celular, y si algunas proteínas se agregan y cómo. Un método más nuevo, el uso de anticuerpos dirigidos a proteínas específicas, se combina con la fractura por congelación para identificar las proteínas y su función en la membrana celular.
