La tinción de Gram es un procedimiento de tinción diferencial que muestra qué bacterias son Gram-positivas o Gram-negativas en función de su color de tinte. El alcohol de acetona es un reactivo utilizado en este proceso para proporcionar la diferenciación del color. Las bacterias Gram-positivas tienen una capa gruesa de peptidoglucano y se tiñen de color púrpura, mientras que los microorganismos Gram-negativos tienen poca o ninguna capa de peptidoglicano y se tiñen de rosa.

Violeta cristalina primaria

Una vez una diapositiva de Se prepara una muestra bacteriana, se usa violeta de cristal para teñir primero la muestra. En este punto, las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas aparecerán de color púrpura. Por lo general, el cristal violeta se aplica en la diapositiva durante 30 segundos antes de lavar cualquier exceso de mancha con agua. La violeta cristal puede adherirse un poco a las capas de peptidoglucano, por lo que no toda la mancha primaria se lavará con el agua.

Mordant-Iodine

El yodo se agrega luego a la muestra durante un minuto . Actúa como un mordiente, que sirve para fijar los tintes en un proceso de tinción. El yodo realiza esta función uniéndose al cristal violeta y creando un complejo insoluble que se adhiere mucho mejor a la gruesa capa de peptidoglicano que se encuentra en las células bacterianas Gram-positivas que solo la violeta cristal sola. No hay un paso de lavado con agua después de agregar el yodo.

Decolorante-Alcohol

Se puede usar acetona o alcohol etílico como agente decolorante. El alcohol disuelve los lípidos que se encuentran en la membrana celular externa de bacterias Gram-negativas, permitiendo que el complejo cristal violeta-yodo se escape de la capa más delgada de peptidoglicano. El alcohol se agrega por 10 a 20 segundos; se vierte en el tobogán hasta que se elimine todo el yodo y la escorrentía no tenga color. En este punto del proceso de tinción de Gram, las bacterias Gram-negativas son incoloras, mientras que las bacterias Gram-positivas aún retienen el cristal violeta. Una vez terminado, la laminilla debe enjuagarse con agua para detener el efecto decolorante.

Contratinción-Safranina

Luego se agrega Safranin para aumentar la visibilidad y el contraste de las bacterias incoloras Gram-negativas. La mancha hace que estas bacterias se vean rosadas bajo el microscopio. Dado que la mancha se agrega a la muestra completa, también tiñe las bacterias Gram-positivas, pero la más oscura de la violeta cristal oculta el color rosa safranín más claro. Una vez que la muestra de portaobjetos se ha inundado con safranina durante aproximadamente un minuto, se usa agua para eliminar el exceso de manchas que no se adhiere a las células bacterianas.