La electroforesis en gel de poliacrilamida permite la separación de alta resolución de proteínas extraídas de muestras biológicas, pero requiere más de un día de pretratamiento para recuperar las proteínas separadas atrapadas dentro del gel para su detección por espectrometría de masas. BAC-DROP, nuestra novedosa tecnología de electroforesis, utiliza una forma soluble de gel de poliacrilamida, lo que permite que el pretratamiento de la muestra se complete en unas cinco horas. La tecnología desarrollada permitirá el diagnóstico rápido de virus y marcadores de proteínas de enfermedades.

La espectrometría de masas (MS) es un método poderoso para el análisis de biomarcadores porque permite una medición altamente sensible y precisa de moléculas diana en muestras clínicas. La aplicación de la EM al diagnóstico clínico, como el cribado metabólico neonatal, ha progresado con un enfoque en los marcadores de metabolitos. La medición de proteínas por EM se utiliza actualmente principalmente para estudios de descubrimiento de nuevos marcadores, pero existe un interés creciente en su aplicación en el diagnóstico de marcadores clínicos como alternativa a los inmunoensayos.

La cuantificación de biomarcadores de proteínas basada en EM se realiza principalmente mediante un enfoque ascendente utilizando fragmentos de péptidos obtenidos por digestión enzimática de proteínas con tripsina. Los protocolos de digestión estándar requieren un tiempo de reacción de más de 20 horas, que es un factor que limita la velocidad en los flujos de trabajo de preparación de muestras.

Aunque la cuantificación de proteínas por EM es muy sensible, El proteoma plasmático y sérico son muy complejos, y la interferencia de otros componentes plantea un desafío importante. Para la detección de alta precisión de marcadores de destino, Se han informado enfoques para la eliminación previa de los principales componentes de las proteínas séricas, como la albúmina, o el enriquecimiento selectivo de marcadores diana utilizando columnas de anticuerpos. pero el efecto fuera del objetivo sobre los resultados cuantitativos y la dificultad de procesar múltiples muestras siguen siendo obstáculos.

En este estudio, nos centramos en geles de poliacrilamida solubles utilizando N, N'-Bis (acriloil) cistamina (BAC) como reticulante para resolver estos problemas. Los geles de poliacrilamida reticulada BAC se disuelven fácilmente mediante un tratamiento de reducción, permitiendo la recuperación de proteínas que se han escapado a la solución. Descubrimos que las proteínas recuperadas eran adecuadas para la digestión rápida de tripsina en condiciones de alta temperatura, y logramos establecer un método de preparación de muestras de alto rendimiento para la cuantificación de biomarcadores basada en MS, que llamamos BAC-DROP (BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE-Resolved Objective Proteins).

El fraccionamiento de proteomas de alta resolución con BAC-DROP es particularmente eficaz para la cuantificación de las proteínas marcadoras de trazas dirigidas por MS derivadas de muestras clínicas. Al introducir BAC-DROP en el flujo de trabajo de cuantificación basado en EM de la proteína C reactiva (PCR) del biomarcador inflamatorio, pudimos completar el pretratamiento de la muestra en solo 5 horas y cuantificamos con éxito la PCR a partir de una muestra de suero humano de 0,5 µl. También logramos un diagnóstico serológico de la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) mediante la cuantificación de HBsAg combinada con BAC-DROP y MS. Recientemente, El interés en el diagnóstico de infecciones virales por EM ha aumentado rápidamente, como lo ejemplifica el diagnóstico de COVID-19. El enfoque de preparación de muestras de alto rendimiento de BAC-DROP que se muestra en este estudio será aplicable no solo al VHB sino también a otras muestras de enfermedades virales infecciosas.