Un equipo de científicos que incluye investigadores del National Synchrotron Light Source II (NSLS-II), una instalación para usuarios de la Oficina de ciencia del Departamento de Energía de EE. UU. En el Laboratorio Nacional Brookhaven del DOE, ha demostrado una nueva técnica para obtener imágenes de proteínas en 3D. con resolución a nanoescala. Su trabajo, publicado en el Revista de la Sociedad Química Estadounidense , permite a los investigadores identificar la ubicación precisa de las proteínas dentro de las células individuales, alcanzando la resolución de la membrana celular y los organelos subcelulares más pequeños.

"En el mundo de la biología estructural, Los científicos utilizan técnicas como la cristalografía de rayos X y la microscopía crioelectrónica para conocer la estructura precisa de las proteínas e inferir sus funciones. pero no aprendemos dónde funcionan en una celda, ", dijo la autora correspondiente y científica de NSLS-II Lisa Miller." Si estás estudiando una enfermedad en particular, necesita saber si una proteína está funcionando en el lugar equivocado o no funciona en absoluto ".

La nueva técnica desarrollada por Miller y sus colegas es similar en estilo a los métodos tradicionales de microscopía de fluorescencia en biología. en el que una molécula llamada proteína verde fluorescente (GFP) se puede unir a otras proteínas para revelar su ubicación. Cuando la GFP se expone a la luz ultravioleta o visible, emite fluorescencia de un color verde brillante, iluminando una proteína que de otro modo sería "invisible" en la célula.

"Con GFP, podemos ver si una proteína está en estructuras subcelulares que tienen un tamaño de cientos de nanómetros, como el núcleo o el citoplasma, "Miller dijo, "pero estructuras como una membrana celular, que tiene un tamaño de solo siete a 10 nanómetros, son difíciles de ver con etiquetas de luz visible como GFP. Para ver estructuras del tamaño de 10 nanómetros en una celda, se beneficia enormemente del uso de rayos X ".

Para superar este desafío, Los investigadores de NSLS-II se asociaron con científicos del Instituto de Tecnología de Massachusetts (MIT) y la Universidad de Boston (BU) que desarrollaron una etiqueta sensible a los rayos X llamada etiqueta de unión a lantánidos (LBT). Los LBT son proteínas muy pequeñas que pueden unirse estrechamente a elementos de la serie de lantánidos, como el erbio y el europio.

"A diferencia de GFP, que emite fluorescencia cuando se expone a la luz ultravioleta o visible, los lantánidos fluorescen en presencia de rayos X, "dijo la autora principal, Tiffany Victor, investigador asociado en NSLS-II. "Y dado que los lantánidos no se encuentran naturalmente en la célula, cuando los vemos con el microscopio de rayos X, conocemos la ubicación de nuestra proteína de interés ".

Los investigadores de NSLS-II, MIT, y BU trabajaron juntos para combinar la tecnología LBT con la fluorescencia de rayos X.

"Aunque los LBT se han utilizado ampliamente durante la última década, nunca se han utilizado para estudios de fluorescencia de rayos X, "Dijo Miller.

Más allá de obtener imágenes de mayor resolución, La fluorescencia de rayos X proporciona simultáneamente imágenes químicas de todos los oligoelementos de una célula, como el calcio, potasio, planchar, cobre, y zinc. En otros estudios, El equipo de Miller está investigando cómo los oligoelementos como el cobre están relacionados con la muerte neuronal en enfermedades como el Alzheimer. Visualizar la ubicación de estos elementos en relación con proteínas específicas será clave para nuevos hallazgos.

Además de su compatibilidad con rayos X, Los LBT también son beneficiosos por su tamaño relativamente pequeño, en comparación con las etiquetas de luz visible.

"Imagina que tienes una cola del tamaño de todo tu cuerpo, o más grande, "Dijo Miller." Habría muchas actividades normales que ya no podrías hacer. Pero si solo tuvieras que caminar con una pequeña cola de cerdo, todavía podrías correr, salto, y pasar por las puertas. La GFP es como la cola grande:puede ser un impedimento real para la función de muchas proteínas. Pero estas pequeñas etiquetas que se unen a los lantánidos son casi invisibles ".

Para demostrar el uso de LBT para obtener imágenes de proteínas en 3-D con resolución a nanoescala, los investigadores de MIT y BU marcaron dos proteínas en una célula bacteriana:una proteína citoplasmática y una proteína de membrana. Luego, El equipo de Miller estudió la muestra en la línea de luz Hard X-ray Nanoprobe (HXN) en NSLS-II y la línea de luz Bionanoprobe en Advanced Photon Source (APS), una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE en el Laboratorio Nacional Argonne del DOE.

"HXN ofrece el tamaño de enfoque de rayos X líder en el mundo, que desciende a unos 12 nanómetros. Esto fue fundamental para obtener imágenes de la célula bacteriana en 3-D con resolución a nanoescala, "dijo Yong Chu, científico principal de líneas de luz en HXN. "También desarrollamos una nueva forma de montar las celdas en un portamuestras especializado para optimizar la eficiencia de las mediciones".

Al combinar la resolución incomparable de HXN con las capacidades de los LBT, el equipo pudo obtener imágenes de ambas proteínas marcadas. Al visualizar la proteína de la membrana celular, los LBT demostrados se pueden ver a alta resolución, mientras que las imágenes de la proteína citoplasmática mostraron que los LBT también podían visualizarse dentro de la célula.

"En altas concentraciones, los lantánidos son tóxicos para las células, "Víctor dijo, "por lo que era importante para nosotros demostrar que podíamos tratar células con una concentración de lantánidos muy baja que no era tóxica y era lo suficientemente sustancial como para atravesar la membrana celular y obtener imágenes de las proteínas que queríamos ver".

Ahora, con esta nueva técnica demostrada con éxito, Los científicos esperan poder utilizar LBT para obtener imágenes de otras proteínas dentro de la célula a una resolución de 10 nanómetros.