Investigadores de la Universidad Ludwig Maximilian (LMU) han desarrollado un método innovador para rastrear simultáneamente procesos dinámicos rápidos de múltiples moléculas a escala molecular.
Los procesos dentro de nuestro cuerpo se caracterizan por la interacción de varias biomoléculas, como las proteínas y el ADN. Estos procesos ocurren a una escala que a menudo se encuentra dentro del rango de unos pocos nanómetros. En consecuencia, no se pueden observar con microscopía de fluorescencia, que tiene un límite de resolución de unos 200 nanómetros debido a la difracción.
Cuando dos colorantes que marcan las posiciones de las biomoléculas están más cerca de este límite óptico, su fluorescencia no se puede distinguir bajo el microscopio. Como esta fluorescencia se utiliza para localizarlos, resulta imposible determinar con precisión sus posiciones.
Este límite de resolución se ha superado tradicionalmente en los métodos de microscopía de superresolución haciendo que los tintes parpadeen y activando y desactivando su fluorescencia. Esto separa temporalmente su fluorescencia, haciéndola distinguible y permitiendo localizaciones por debajo del límite de resolución clásico.
Sin embargo, para aplicaciones que implican el estudio de procesos dinámicos rápidos, este truco tiene un inconveniente importante:el parpadeo impide la localización simultánea de múltiples tintes. Esto reduce significativamente la resolución temporal al investigar procesos dinámicos que involucran múltiples biomoléculas.
Bajo el liderazgo del químico de la LMU, el profesor Philip Tinnefeld, y en cooperación con el profesor Fernando Stefani (Buenos Aires), los investigadores de la LMU han desarrollado la multiplexación pMINFLUX, un enfoque elegante para abordar este problema.
El equipo ha publicado un artículo sobre su método en la revista Nature Photonics. .
MINFLUX es un método de microscopía de superresolución que permite localizaciones con precisiones de tan solo un nanómetro. A diferencia del MINFLUX convencional, pMINFLUX registra la diferencia de tiempo entre la excitación de los colorantes con un pulso láser y la fluorescencia posterior con una resolución inferior a nanosegundos.
Además de localizar los tintes, esto proporciona información sobre otra propiedad fundamental de su fluorescencia:su vida útil de fluorescencia. Esto describe cuánto tiempo, en promedio, tarda una molécula de tinte en emitir fluorescencia después de excitarse.
"La vida útil de la fluorescencia depende del tinte utilizado", explica Fiona Cole, coprimera autora de la publicación. "Aprovechamos las diferencias en la duración de la fluorescencia cuando utilizamos diferentes tintes para asignar los fotones fluorescentes al tinte que se emitía sin necesidad de parpadear y sin la separación temporal resultante".
Para ello, los investigadores adaptaron el algoritmo de localización e incluyeron un modelo de ajuste multiexponencial para lograr la separación requerida.
"Esto nos permitió determinar la posición de varios colorantes simultáneamente e investigar procesos dinámicos rápidos entre múltiples moléculas con precisión nanométrica", añade Jonas Zähringer, también coautor del estudio.
Los investigadores demostraron su método rastreando con precisión dos hebras de ADN mientras saltaban entre diferentes posiciones en una nanoestructura de origami de ADN, así como separando los movimientos de traslación y rotación de una nanoestructura de origami de ADN y midiendo la distancia entre los sitios de unión a antígenos de los anticuerpos.
"Pero esto es sólo el comienzo", afirma Philip Tinnefeld. "Estoy seguro de que la multiplexación de pMINFLUX, con su alta resolución temporal y espacial, proporcionará nuevos conocimientos sobre las interacciones de proteínas y otros fenómenos biológicos en el futuro."
Más información: Fiona Cole et al, FRET superresuelto y seguimiento conjunto en pMINFLUX, Nature Photonics (2024). DOI:10.1038/s41566-024-01384-4
Información de la revista: Fotónica de la naturaleza
Proporcionado por la Universidad Ludwig Maximilian de Munich
