Esta micrografía electrónica de transmisión muestra un nanoporo de estado sólido:el círculo blanco en el medio de la imagen. La estructura de aspecto irregular es el resultado de la naturaleza policristalina de una película de oro que se evaporó sobre la membrana de nitruro de silicio (que no se puede ver). Crédito:Grupo Rant, TU Muenchen Copyright TU Muenchen
Un nuevo tipo de sensor, basado en poros a escala nanométrica en una membrana semiconductora, es un paso más hacia el uso práctico en aplicaciones como el análisis del contenido de proteínas de una sola célula. Los investigadores que fueron pioneros en la tecnología de sensores de nanoporos de una sola molécula en la Technische Universität München (TUM) han demostrado su potencial a través de una sucesión de experimentos en los últimos años. Ahora, en colaboración con bioquímicos de la Universidad Goethe de Frankfurt, han podido hacer avanzar este esfuerzo más allá de lo que había sido un punto de fricción:mejorar la selectividad del sensor mientras se mantiene su sensibilidad a moléculas individuales. Informan los últimos resultados en Nanotecnología de la naturaleza .
La investigación destinada a fabricar y controlar dispositivos de diagnóstico a escala de moléculas biológicas ha avanzado hasta el punto en que varios enfoques diferentes se consideran competitivos para su aplicación práctica en un futuro relativamente cercano. La búsqueda no es crear un universal, sensor de amplio espectro, sino más bien una tecnología para detectar e identificar moléculas individuales de proteínas específicamente dirigidas, sin la necesidad de modificarlas agregando "etiquetas" bioquímicas. Esta tecnología podría utilizarse, por ejemplo, acelerar la traducción de los conocimientos de la genómica al conocimiento práctico de la proteómica. Esto es de vital interés para la investigación médica y farmacéutica, así como para estudios biológicos más fundamentales. Otra aplicación potencial que se menciona con frecuencia es la detección de agentes de guerra biológica.
Uno de los enfoques más prometedores se basa en la ingeniería de un punto de control molecular, "un pasaje monitoreado entre dos soluciones salinas separadas por una membrana artificial. Este llamado nanoporo tiene un tamaño y forma que las moléculas deben pasar de una en una. La presencia de una molécula en la vía produce cambios medibles en la conductividad eléctrica a través del nanoporo, y más refinamientos pueden afinar dicho detector para convertirlo en un "control de identidad" altamente específico para moléculas objetivo. Lo que ha permitido la colaboración Munich-Frankfurt es un método robusto y reversible para hacer este ajuste fino:equipar un sensor de nanoporos inorgánicos con funcionalidad biológica mediante el anclaje de receptores moleculares en su interior. Los equipos fueron dirigidos por el Dr. Ulrich Rant, del Instituto Walter Schottky de TUM y el Instituto de Estudios Avanzados de TUM, y el Prof. Dr. Robert Tampé del Instituto de Bioquímica de la Universidad Goethe de Frankfurt y los Complejos Macromoleculares del Cluster of Excellence Frankfurt (CEF).
Esta ilustración esquemática muestra un nanoporo de estado sólido recubierto de oro que se modifica químicamente con un solo receptor capaz de unir moléculas de proteína con un conjunto específico de residuos de aminoácidos. Una traza ejemplar de corriente versus tiempo muestra la unión transitoria de proteínas individuales. Crédito:Grupo Rant, TU Muenchen, Copyright TU Muenchen.
"Lo que encuentro asombroso sobre los nanoporos, "Rant dice, "es su rentabilidad:ya se pueden realizar experimentos de una sola molécula con equipos por un valor de sólo un par de miles de euros. Si la tecnología se comercializa más, Estoy seguro de que los instrumentos podrían venderse por el precio de una computadora personal, potencialmente permitiendo a las personas detectar moléculas individuales en casa ".
La fabricación de estos dispositivos experimentales comenzó con un sustrato de nitruro de silicio de solo 50 nanómetros de espesor; por lo tanto, la membrana era literalmente un chip semiconductor (aunque no, por supuesto, un circuito integrado). Herramientas estándar de la industria microelectrónica, litografía por haz de electrones y grabado con iones reactivos, se utilizaron para perforar la membrana de nitruro de silicio con nanoporos de 20 a 50 nm de diámetro. La deposición de vapor se utilizó para recubrir los poros con titanio y oro, y el metal, a su vez, recibió un recubrimiento químico autoensamblado de una capa molecular de espesor. Los nanoporos resultantes tenían una forma cónica ahusada con un diámetro en el extremo estrecho de alrededor de 25 nm; anclados en la capa superficial había un pequeño número de receptores bioquímicos diseñados para capturar e inmovilizar la proteína que daría al sensor su funcionalidad biológica. Para estos experimentos, los chips se montaron en una cámara de medición con una solución de electrolito a cada lado; Las moléculas de proteína agregadas a un lado de la cámara fueron impulsadas a través del nanoporo mediante una carga eléctrica. Los rastros de cambios en la corriente eléctrica arrojaron mediciones en tiempo real de moléculas individuales a medida que pasaban a través de los nanoporos, o permanecían mientras interactuaban con la proteína inmovilizada, y estos datos a su vez proporcionaron una identificación positiva de las moléculas objetivo.
La interpretación de este artista ilustra cómo se prueban proteínas individuales con un nanoporo diseñado artificialmente en una membrana de estado sólido metalizada. Una proteína primaria (rojo oscuro) anclada dentro del poro se une transitoriamente al anticuerpo anIgG (rojo claro) que pasa a través del poro. El tiempo de interacción puede medirse eléctricamente (en la parte superior de la imagen se muestra una traza ejemplar de corriente frente a tiempo); esto revela la función biológica del anticuerpo. Se utiliza una alfombra de moléculas autoensambladas (pelos blancos) para revestir las paredes de los poros de oro. haciendo que la superficie sea biológicamente inerte. Crédito:Christof Hohmann, Iniciativa de Nanosistemas de Clúster de Excelencia de Múnich (NIM), derechos de autor NIM
Los investigadores pudieron detectar proteínas etiquetadas con histidina recombinante, y también para discriminar entre subclases de anticuerpos IgG naturales (de ratas y hámsteres). En el pasado, este nivel de selectividad solo podría lograrse a expensas de la sensibilidad de una sola molécula. Los resultados informados en Nanotecnología de la naturaleza demostrar que este obstáculo se puede superar, y más, que el enfoque es extremadamente versátil. Como explica Rant, "El método que empleamos para anclar proteínas individuales dentro del poro es bastante genérico y funciona para muchas proteínas recombinantes disponibles. Por lo tanto, es fácil dotar al nanoporo de estado sólido de la funcionalidad biológica deseada. Simplemente seleccione una proteína adecuada, que reconoce específicamente las proteínas diana de interés, y utilícelo para sondear las proteínas a medida que pasan ".
"El futuro sigue siendo emocionante, "Tampé dice, "porque la naturaleza está muy por delante de nosotros en términos de selectividad y especificidad. Por lo tanto, se necesitan más mejoras en el campo de los sistemas sensoriales artificiales a nivel molecular. La colaboración entre los equipos de Munich y Frankfurt representa un paso importante en la tecnología biosensoria y nanodiagnóstica en el nivel de moléculas individuales ". Rant agrega, "La mayor parte de la investigación reciente sobre nanoporos se ha dirigido a la detección y secuenciación de ADN. Espero que nuestros resultados muestren que los nanoporos tienen el potencial de convertirse también en herramientas importantes para la investigación de proteínas. ¿Y quién sabe? Quizás pronto veamos la introducción de nanoporos de proteínas. sensores como instrumentos de diagnóstico para detectar marcadores de enfermedades de baja abundancia en las muestras de los pacientes ".
