Cuando los científicos necesitaban visualizar la estructura de la proteína de pico, que los coronavirus utilizan para infiltrarse en las células humanas, recurrieron a la microscopía crioelectrónica. Una de las herramientas de imágenes más poderosas en el arsenal de un investigador, microscopía crioelectrónica (crio-EM) puede visualizar proteínas, patógenos y diversos componentes celulares casi hasta sus átomos individuales.

Pero preparar muestras para crio-EM es un proceso engorroso que se basa en etano, un poderoso refrigerante en forma líquida, y un gas inflamable a temperatura ambiente propenso a explosiones.

Un nuevo estudio publicado el 7 de septiembre en la Revista de la Unión Internacional de Cristalografía demuestra que las muestras crio-EM se pueden preparar con un refrigerante más seguro y menos costoso, el nitrógeno líquido, y estas muestras pueden producir imágenes aún más nítidas que las preparadas con etano. Los hallazgos trastocan la sabiduría convencional que se remonta a la década de 1980, y puede mejorar la seguridad y la calidad de cryo-EM.

"El etano no es un producto químico estándar de laboratorio. Es peligroso, y su uso agrega complicaciones adicionales, "dijo el autor principal Robert Thorne, profesor de física en la Facultad de Artes y Ciencias y miembro presidencial de Weiss. "El nitrógeno líquido es el refrigerante preferido".

Cryo-EM funciona disparando electrones a través de moléculas que se congelan instantáneamente en una lámina de agua vidriosa. capturando múltiples imágenes borrosas de las moléculas dentro del hielo. El software sofisticado a menudo puede promediar esos clips borrosos en una imagen 3D nítida, pero no de manera consistente.

Parte de la borrosidad proviene de la propia muestra. Cuando el agua que contiene las moléculas se enfría demasiado lentamente, forma cristales de hielo que degradan la imagen. Los científicos evitan este problema utilizando etano para enfriar el agua tan rápidamente que se convierte en un cristalino hoja sin cristales. Pero una congelación tan rápida pone tensión en la sábana, que descansa sobre una fina película de oro. Cuando el haz de electrones golpea la hoja, el estrés hace que las moléculas se muevan, difuminar la imagen final en un fenómeno conocido como movimiento inducido por haz.

"Tenemos dos factores opuestos, ", Dijo Thorne." Queremos enfriar las muestras rápidamente, para prevenir la formación de cristales de hielo y capturar la estructura biológica de las moléculas. Pero también queremos enfriar las muestras lo más lentamente posible para minimizar su movimiento durante la toma de imágenes ".

El etano enfría las muestras muy rápidamente. Pero los investigadores deben usar nitrógeno líquido para convertir el gas etano en líquido, y luego más nitrógeno líquido para almacenar las muestras una vez congeladas. "El etano es engorroso, es peligroso, y, por último, las muestras terminan en nitrógeno líquido de todos modos, "Dijo Thorne.

El nitrógeno líquido se enfría a velocidades aproximadamente 50 veces más lentas que las del etano, según informes de los últimos 40 años, y eso no es lo suficientemente rápido para convertir el agua en una hoja vidriosa. Pero en 2006, El grupo de investigación de Thorne descubrió que el factor principal que ralentizaba el nitrógeno era el gas frío que flotaba sobre la superficie del líquido. que enfrió pequeñas muestras antes de que llegaran al líquido.

La compañía de Thorne, MiTeGen, finalmente desarrolló un instrumento de enfriamiento automático para cristalografía de rayos X, otro método utilizado para obtener imágenes de moléculas de proteínas, que elimina el gas frío justo antes de que una muestra se sumerja en nitrógeno, y encontró que las velocidades de enfriamiento aumentaron a apenas seis veces más lento que el etano. Luego, el personal de MiTeGen adaptó su instrumento de enfriamiento para muestras crio-EM y colaboró ​​con el personal del Centro de Investigación de Materiales de Cornell y el asociado postdoctoral Jonathan Clinger para recopilar y analizar datos crio-EM.

Como informa el nuevo estudio, el nitrógeno se enfría a la velocidad perfecta para la preparación de muestras crio-EM, lo suficientemente rápido como para evitar la formación significativa de cristales de hielo, pero lo suficientemente lento como para reducir el movimiento inducido por el haz más adelante.

"El etano es exagerado, "Thorne dijo." Para la velocidad que no necesita, obtienes imágenes borrosas con movimiento inducido por el haz, y eso es más problemático que cualquier cristal de hielo que se forma a partir de un enfriamiento ligeramente más lento ".

Y refrigeración con nitrógeno totalmente líquido, Thorne dijo:simplificará los flujos de trabajo de cryo-EM, eliminando los pasos adicionales exigidos por el etano y facilitando el diseño de instrumentos de enfriamiento automatizados que cumplan con los estándares de seguridad de laboratorio actuales.

"Esta es una buena ilustración de cómo la ciencia académica básica, que investiga cómo se enfrían los objetos pequeños y cómo se forma el hielo dentro de ellos, puede conducir a soluciones prácticas y productos comerciales".