Los microscopios convencionales proporcionan información esencial sobre las muestras en dos dimensiones:el plano del portaobjetos del microscopio. Pero plano no es todo eso. En muchas instancias, la información sobre el objeto en la tercera dimensión, el eje perpendicular al portaobjetos del microscopio, es igualmente importante de medir.

Por ejemplo, para comprender la función de una muestra biológica, si es una hebra de ADN, tejido, órgano u organismo microscópico, A los investigadores les gustaría tener la mayor cantidad de información posible sobre la estructura tridimensional y el movimiento del objeto. Las mediciones bidimensionales producen una comprensión incompleta y, a veces, insatisfactoria de la muestra.

Ahora, los investigadores del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) han encontrado una manera de convertir un problema que afecta a casi todos los microscopios ópticos:aberraciones de lentes, que provocan un enfoque imperfecto de la luz, en una solución que permite a los microscopios convencionales medir con precisión las posiciones de los puntos de luz en una muestra en las tres dimensiones.

Aunque otros métodos han permitido que los microscopios proporcionen información detallada sobre la estructura tridimensional, estas estrategias han tendido a ser costosas o requerir conocimientos especializados. En un enfoque anterior para medir posiciones en la tercera dimensión, los investigadores alteraron la óptica de los microscopios, por ejemplo, agregando astigmatismo adicional a las lentes. Tales alteraciones a menudo requerían reingeniería y recalibración del microscopio óptico después de que salía de fábrica.

El nuevo método de medición también permite a los microscopios localizar con mayor precisión y precisión las posiciones de los objetos. Los microscopios ópticos normalmente resuelven las posiciones de los objetos en una región no menor a unos pocos cientos de nanómetros (mil millonésimas de metro), un límite establecido por la longitud de onda de la luz que hace la imagen y el poder de resolución de las lentes del microscopio. Con la nueva técnica, Los microscopios convencionales pueden señalar las posiciones de las partículas emisoras de luz individuales dentro de una región de una centésima parte tan pequeña.

Los investigadores del NIST Samuel Stavis, Craig Copeland y sus colegas describieron su trabajo en la edición del 24 de junio de Comunicaciones de la naturaleza .

El método se basa en un análisis cuidadoso de imágenes de partículas fluorescentes que los investigadores depositaron en obleas de silicio planas para la calibración de su microscopio. Debido a las aberraciones de la lente, a medida que el microscopio se movía hacia arriba y hacia abajo en incrementos específicos a lo largo del eje vertical, la tercera dimensión, las imágenes parecían torcidas y las formas y posiciones de las partículas parecían cambiar. Los investigadores del NIST encontraron que las aberraciones pueden producir grandes distorsiones en las imágenes incluso si el microscopio se mueve solo unos pocos micrómetros (millonésimas de metro) en el plano lateral o unas pocas decenas de nanómetros en la dimensión vertical.

El análisis permitió a los investigadores modelar exactamente cómo las aberraciones de la lente alteraron la apariencia y la ubicación aparente de las partículas fluorescentes con cambios en la posición vertical. Calibrando cuidadosamente la apariencia cambiante y la ubicación aparente de una partícula en su posición vertical, el equipo logró utilizar el microscopio para medir con precisión las posiciones en las tres dimensiones.

"Contraintuitivamente, las aberraciones de la lente limitan la precisión en dos dimensiones y permiten la precisión en tres dimensiones, "dijo Stavis." De esta manera, nuestro estudio cambia la perspectiva de la dimensionalidad de las imágenes de microscopio óptico, y revela el potencial de los microscopios ordinarios para realizar mediciones extraordinarias ".

El uso de la información latente proporcionada por las aberraciones de la lente complementa los métodos menos accesibles que los microscopistas emplean actualmente para realizar mediciones en la tercera dimensión. Stavis señaló. El nuevo método tiene el potencial de ampliar la disponibilidad de tales mediciones.

Los científicos probaron su método de calibración utilizando el microscopio para obtener imágenes de una constelación de partículas fluorescentes depositadas al azar en un engranaje de silicio microscópico que giraba en las tres dimensiones. Los investigadores demostraron que su modelo corrigió con precisión las aberraciones de la lente, permitiendo que el microscopio proporcione información tridimensional completa sobre la posición de las partículas.

Luego, los investigadores pudieron extender sus mediciones de posición para capturar todo el rango de movimiento del engranaje, incluyendo su rotación, tambaleándose y balanceándose, completar la extracción de información espacial del sistema. Estas nuevas mediciones destacaron las consecuencias de las brechas a nanoescala entre las partes del microsistema, que varió debido a imperfecciones en la fabricación del sistema. Así como un cojinete suelto de una rueda hace que se tambalee, El estudio mostró que los espacios a nanoescala entre las partes no solo degradaron la precisión de la rotación intencional, pero también causó un bamboleo involuntario, balanceo e incluso flexión del equipo, todo lo cual podría limitar su rendimiento y confiabilidad.

Los laboratorios de microscopía podrían implementar fácilmente el nuevo método, Dijo Copeland. "El usuario solo necesita una muestra estándar para medir sus efectos y una calibración para usar los datos resultantes, "añadió Stavis. Aparte de las partículas fluorescentes o un estándar similar, que ya existen o están surgiendo, no se necesita equipo adicional. El nuevo artículo de la revista incluye un software de demostración que guía a los investigadores sobre cómo aplicar la calibración.