a, Esquema de la configuración. Las micrografías espectrales de fotograma completo se obtienen mediante la modulación rápida sincronizada de la longitud de onda de excitación en fotogramas consecutivos. PAG, polarizador L, lente; F, filtro de paso de banda; DM, espejo dicroico. B, Imágenes sin mezclar de 6 objetivos subcelulares en una celda COS-7 en vivo con 8 longitudes de onda de excitación. LipidSpot 488:gotas de lípidos (LD), SYBR Green:ADN mitocondrial, Mito-PhiYFP:matriz mitocondrial, WGA-CF532:membrana celular, Naranja LysoBrite:lisosomas, tdTomato-ER3:ER. C, Espectros de excitación de referencia de los 6 fluoróforos, medido por separado en la configuración utilizando muestras etiquetadas individualmente. D, Mapas de pH absoluto Mito-pHRed de la matriz mitocondrial en una célula HeLa viva, antes (arriba) y después (abajo) 120 s de tratamiento con CCCP 20 μM. mi, Mapas FRET codificados por colores para un sensor de aglomeración macromolecular, para dos células COS-7 vivas antes (izquierda), ~ 10 s después (centro), y ~ 25 s después (derecha) tratamiento hipertónico al 150%. F, Imágenes sin mezclar del mapa de pH absoluto Mito-pHRed codificado por colores, mOrange2-Parkin, PhiYFP-LC3, y LAMP1-Clover para dos células HeLa vivas que expresan Parkin después de la aplicación de CCCP 20 μM durante 4 h. gramo, Zoom del cuadro blanco en (f) Crédito:Kun Chen, Rui Yan, Limin Xiang, y Ke Xu
La capacidad de multiplexación de la microscopía de fluorescencia está severamente limitada por la amplia amplitud espectral de fluorescencia. La imagen espectral ofrece posibles soluciones, sin embargo, los enfoques típicos para dispersar los espectros de emisión local impiden notablemente el rendimiento alcanzable y ponen restricciones sustanciales en la resolución temporal. Los filtros de paso de banda sintonizables brindan la posibilidad de escanear a través de la longitud de onda de emisión en el campo amplio. Sin embargo, la aplicación de pasos de banda estrechos a la emisión de fluorescencia da como resultado un uso ineficaz de la escasa señal.
En un nuevo artículo publicado en Luz:ciencia y aplicaciones , un equipo de científicos, dirigido por el profesor Ke Xu de la Facultad de Química, Universidad de California, Berkeley, Estados Unidos ha demostrado que el uso de un solo banda de detección de emisión de fluorescencia fija, a través de un escaneo rápido sincronizado en cuadro de la longitud de onda de excitación de una lámpara blanca a través de un filtro sintonizable acústico-óptico (AOTF), hasta 6 objetivos subcelulares, etiquetado por fluoróforos comunes de superposición espectral sustancial, se pueden obtener imágenes simultáneamente en células vivas con diafonía baja (~ 1%) y alta resolución temporal (hasta ~ 10 ms).
La capacidad demostrada para cuantificar la abundancia de diferentes fluoróforos en la misma muestra mediante la desmezcla de los espectros de excitación a continuación les permitió idear nuevos, Esquemas de imágenes cuantitativas para biosensores fluorescentes de dos estados y FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) en células vivas. De este modo, lograron altas sensibilidades de fotograma completo y resoluciones espacio-temporales en la cuantificación del pH de la matriz mitocondrial y el apiñamiento macromolecular intracelular. De este modo, revelaron importantes heterogeneidades espaciales en ambos parámetros, incluyendo saltos repentinos espontáneos en el pH de la matriz mitocondrial acompañados de cambios dramáticos en la forma mitocondrial. Además demostraron, por primera vez, la multiplexación de imágenes de pH absoluto con tres orgánulos / proteínas diana adicionales para dilucidar el complejo, Vía de la mitofagia mediada por parkina.
"La posible extensión de nuestro enfoque a más fluoróforos se puede lograr aumentando aún más el número de longitudes de onda de excitación o integrando la dispersión de emisiones. Mientras que en este trabajo nos enfocamos en un sistema sencillo basado en un microscopio de epifluorescencia operado por lámpara, Las rápidas capacidades de obtención de imágenes de biosensores cuantitativos y de múltiples fluoróforos que demostramos aquí deberían ser fácilmente ampliables a otros sistemas, incluyendo microscopía de fluorescencia de hoja de luz y microscopía de iluminación estructurada ", comentaron los científicos.
Juntos, Estos resultados "revelan las oportunidades excepcionales que brinda la microscopía espectral de excitación para obtener imágenes de fluorescencia altamente multiplexadas. La perspectiva de adquirir imágenes espectrales rápidas en el campo amplio sin la necesidad de dispersión de fluorescencia o el cuidado de la respuesta espectral del detector ofrece un enorme potencial, "concluyen los científicos.
