a, Diagrama de energía de STED-SREF. B, Configuración de espectroscopia de STED-SREF. Aquí se utiliza el modo nitrilo de Rhodamine 800 (Rh800). C, Imágenes SREF / STED-SREF de células de E. coli teñidas con Rh800 con longitudes de onda de bombeo fijadas en 836 nm (fuera de la resonancia del modo de nitrilo) y 838 nm (resonancia vibratoria del modo de nitrilo). El acoplamiento directo del agotamiento de la emisión estimulada (STED) con las imágenes SREF no logra las mejoras de resolución deseadas. El fondo de fluorescencia anti-Stokes (mostrado en la bomba SREF =836 nm) tiene un papel no deseado en la prevención de la adopción directa de la técnica de fluorescencia de superresolución. Crédito:Hanqing Xiong †, Naixin Qian †, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
La obtención de imágenes de superresolución verdadera más allá del límite de difracción sigue siendo un desafío importante para la microscopía Raman de campo lejano, especialmente en aplicaciones biológicas. Aprovechando la fluorescencia excitada Raman estimulada (SREF) como un contraste vibracional ultrasensible, Un equipo de la Universidad de Columbia ha inventado recientemente una nueva microscopía vibratoria de superresolución. Su nuevo método abre una superresolución, imágenes vibratorias multicolores de resolución espectral nanométrica de sistemas biológicos.
Ha sido una búsqueda larga desarrollar técnicas de imágenes de superresolución para microscopía Raman, que tiene ventajas intrínsecas de especificidad química sobre su contraparte de fluorescencia. A pesar de la importancia percibida y los extensos esfuerzos de investigación, La imagen Raman de superresolución verdadera (definida como difracción ilimitada) de sistemas biológicos en el campo óptico lejano sigue siendo un desafío debido a la deficiencia en la sensibilidad para la dispersión Raman convencional. Como consecuencia, Los métodos de imágenes vibracionales de superresolución informados se basan en la saturación de la excitación, agotando o no linealidad de alto orden de las transiciones Raman. Estos requieren una potencia láser extremadamente intensa para lograr una mejora de resolución moderada (a menudo menos de un factor de 2), lo que inhibe su utilidad para aplicaciones biológicas.
En un nuevo artículo publicado en Luz:ciencia y aplicaciones , un equipo de científicos, dirigido por el profesor Wei Min de la Universidad de Columbia, ESTADOS UNIDOS, ha desarrollado una novedosa microscopía vibratoria de superresolución que aprovecha la fluorescencia excitada Raman estimulada (SREF) como un contraste vibracional ultrasensible. SREF acopla la excitación vibracional con la detección de fluorescencia y permite la espectroscopía Raman de campo lejano con una sensibilidad de hasta una sola molécula. Sin embargo, El acoplamiento directo del agotamiento de la emisión estimulada (STED) con las imágenes SREF no logra obtener imágenes de superresolución debido a la presencia del fondo de fluorescencia anti-Stokes. que no puede ser agotado por el rayo STED.
a, el espectro SREF sin procesar del modo de nitrilo Rh800 adquirido por excitación SREF convencional (curva roja) y el espectro FM-SREF sin fondo correspondiente adquirido por excitación FM-SREF. B, las imágenes de FM-SREF y las imágenes de dispersión Raman estimuladas por resonancia previa electrónica (epr-SRS) de células de E. coli teñidas con Rh800. C, la distribución de intensidad correspondiente para FM-SREF y epr-SRS a lo largo de las correspondientes líneas punteadas blancas en (b). D, estructuras químicas de los dos tintes SREF empleados. mi, los espectros de absorción (curvas sólidas) y los espectros de emisión (curvas de trazos) de los dos tintes en agua, que no se pueden resolver con espectroscopía de fluorescencia convencional. F, los espectros FM-SREF de los modos de nitrilo de los dos colorantes. gramo, imagen multicolor FM-SREF de células de S. cerevisiae. Crédito:Hanqing Xiong †, Naixin Qian †, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
En este nuevo trabajo, el equipo ideó una estrategia de modulación de frecuencia (FM) para eliminar este fondo de banda ancha. Modulando temporalmente la frecuencia de excitación dentro y fuera de la resonancia vibratoria objetivo, pero aún dentro del amplio ancho de línea del fondo, pueden generar una modulación de intensidad en la señal vibratoria pura (pero no en el fondo). La señal vibratoria sin fondo se puede demodular posteriormente mediante una detección de bloqueo. En comparación con el espectro SREF sin procesar típico, el espectro adquirido por FM-SREF representa la señal SREF pura, que permite obtener imágenes SREF sin fondo de alto contraste. Además, sintetizaron nuevos tintes SREF editados con isótopos para facilitar la obtención de imágenes biológicas FM-SREF multicolor con un contraste vibracional nítido. Dos colores vibratorios están separados por FM-SREF con un mínimo de diafonía, lo cual es casi imposible por microscopía de fluorescencia convencional. Tal especificidad química de la formación de imágenes vibracionales tiene ventajas únicas para la formación de imágenes ópticas multiplexadas.
a, el diagrama del sistema de microscopía STED-FM-SREF. B, obtención de imágenes de las mismas células de E. coli teñidas con Rh800 mediante microscopía FM-SREF y microscopía STED-FM-SREF y las distribuciones de intensidad correspondientes a lo largo de las líneas discontinuas. C, obtención de imágenes del mismo núcleo de células Cos7 teñidas con compuesto A mediante microscopía FM-SREF y microscopía STED-FM-SREF y las distribuciones de intensidad correspondientes a lo largo de las líneas discontinuas. Crédito:Hanqing Xiong †, Naixin Qian †, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Finalmente, integrando STED con FM-SREF sin fondo, lograron imágenes vibratorias de súper resolución de alto contraste con STED-FM-SREF, cuya resolución espacial solo está determinada por la relación señal-ruido. Demostraron una mejora de resolución de más de dos veces en sistemas biológicos con potencia de excitación láser moderada. Con la optimización futura de la instrumentación y las sondas de imágenes, La microscopía STED-FM-SREF está diseñada para ayudar a una amplia variedad de aplicaciones biológicas, con su magnífica resolución, alta sensibilidad, contraste vibratorio único, y potencia de excitación biocompatible.
