Imágenes de fluorescencia confocal de superficies de vidrio recubiertas con los tintes de cianina Alexa Fluor 647 (a) y CF660C (b) y con el tinte de carborrodamina ATTO647N (c) después de la excitación de luz a 568 nanómetros (nm). Al excitar los tintes que absorben rojo a 640 nm en ciertas áreas (imágenes negativas arriba a la derecha), Los tintes se fotoconvierten allí y es posible escribir letras en la superficie que se excitaron a 568 nm y emitieron fluorescencia a aproximadamente 580 nm. El colorante de carborrodamina muestra un fotoazulado más eficaz que los colorantes de cianina. Crédito:Equipo Markus Sauer / Universidad de Würzburg
Los últimos avances en microscopía de fluorescencia permiten obtener imágenes de moléculas individuales en células o complejos moleculares con una resolución espacial de hasta 20 nanómetros. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, Se produce un efecto que falsea los resultados:la luz láser utilizada puede provocar la formación de moléculas de oxígeno muy reactivas en la muestra. Estos pueden dañar los tintes fluorescentes utilizados hasta tal punto que ya no emiten fluorescencia. Entre los expertos en microscopía, este efecto se conoce como fotoblanqueo.
Sin embargo, También se pueden transformar varios tintes fluorescentes mediante fotoblanqueo para que absorban luz de longitudes de onda más cortas. "Un tinte fluorescente previamente rojo luego se ilumina en verde. Su fluorescencia se ha desplazado hacia el rango azul en la escala de longitud de onda. Por eso este efecto se llama fotoazulización, "explica el profesor Markus Sauer, un experto en microscopía de superresolución del Biocentro de Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) en Baviera, Alemania.
Primera descripción exacta de photoblueing
El equipo de Sauer presenta ahora por primera vez en la revista el mecanismo molecular exacto de fotoazulización para tintes de cianina como Cy5. Métodos de la naturaleza . El Dr. Martin Schnermann del Centro de Investigación del Cáncer de Frederick (EE. UU.) También participa en la publicación.
"Porque entendimos el mecanismo con tanta precisión, pudimos prevenir el fotoazullamiento con simples aditivos como la vitamina C o aumentarlo agregando una especie de catalizador, "dice Markus Sauer.
Evitar el fotoazullo puede ser muy importante. Aunque el efecto solo puede afectar a un pequeño porcentaje del tinte utilizado, Sin embargo, puede dar lugar a errores o malas interpretaciones de la microscopía. por ejemplo en experimentos de transferencia de energía (FRET). Esto se debe a que los colorantes convertidos se detectan con la misma alta sensibilidad que los productos de partida.
Los búferes simples evitan el fotoazullamiento
"Nuestros resultados muestran qué tintes se ven afectados y cómo se puede prevenir el fotoazullo mediante simples adiciones de tampón, "Sauer dice, con respecto al contenido de la Métodos de la naturaleza papel. "Pero también muestran cómo la fotoazulización se puede utilizar de forma ventajosa para la obtención de imágenes de fluorescencia y para el seguimiento de una sola, moléculas de colorante específicamente convertidas ".
Eso es exactamente lo que el equipo de Sauer planea abordar a continuación:Photoblueing se desarrollará aún más para, entre otras cosas, el seguimiento dirigido de partículas bacterianas y virales individuales en los procesos de infección. El trabajo aquí descrito fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación DFG.
