El esquema del microscopio de matriz de reflexión que fue desarrollado por investigadores del Centro de Investigación de Dinámica y Espectroscopía Molecular del IBS. El sistema utiliza escaneo confocal y un interferómetro Mach-Zehnder, similar a la microscopía de coherencia óptica. Sin embargo, en lugar de detección confocal, Las imágenes interferométricas de ondas reflejadas de la muestra se miden usando una cámara. Además, Se introduce un modulador de luz espacial (SLM) para corregir físicamente la distorsión del frente de onda inducida por la muestra. (BS:divisor de haz, GMx / y:espejo Galvo, DG:Rejilla de difracción, sDM:Espejo dicroico espectral, OL:Lente objetiva) Crédito:IBS
Las técnicas microscópicas no invasivas, como la microscopía de coherencia óptica y la microscopía de dos fotones, se utilizan comúnmente para obtener imágenes in vivo de tejidos vivos. Cuando la luz atraviesa materiales turbios como tejidos biológicos, Se generan dos tipos de luz:fotones balísticos y fotones de dispersión múltiple. Los fotones balísticos viajan directamente a través del objeto sin experimentar ninguna desviación y, por lo tanto, se utilizan para reconstruir la imagen del objeto. Por otra parte, los fotones dispersos múltiples se generan a través de desviaciones aleatorias a medida que la luz pasa a través del material y se muestran como ruido de moteado en la imagen reconstruida. A medida que la luz se propaga a través de distancias crecientes, la relación entre fotones balísticos y multiplicados por dispersión aumenta drásticamente, oscureciendo así la información de la imagen. Además del ruido generado por la luz de dispersión múltiple, La aberración óptica de la luz balística también provoca una reducción del contraste y una imagen borrosa durante el proceso de reconstrucción de la imagen.
Los tejidos óseos, en particular, tienen numerosas estructuras internas complejas, que causan múltiples dispersiones de luz severas y aberraciones ópticas complejas. Cuando se trata de imágenes ópticas del cerebro de un ratón a través de un cráneo intacto, las estructuras finas del sistema nervioso son difíciles de visualizar debido al fuerte ruido moteado y la distorsión de la imagen. Esto es problemático en la investigación de neurociencias, donde el ratón se usa ampliamente como organismo modelo. Debido a la limitación de las técnicas de imagen utilizadas actualmente, el cráneo tiene que ser eliminado o adelgazado para investigar microscópicamente las redes neuronales de los tejidos cerebrales que se encuentran debajo.
Por lo tanto, se han sugerido otras soluciones para lograr imágenes más profundas de los tejidos vivos. Por ejemplo, La microscopía de tres fotones se ha utilizado con éxito para obtener imágenes de neuronas debajo del cráneo del ratón en los últimos años. Sin embargo, La microscopía de tres fotones está limitada por una baja tasa de repetición de láser, ya que emplea una ventana de excitación en el rango infrarrojo. que puede dañar el tejido vivo durante la obtención de imágenes in vivo. También tiene un poder de excitación excesivo, lo que significa que el fotoblanqueo es más extenso en comparación con el enfoque de dos fotones.
(a) Se usó un objetivo de resolución en estrella de Siemens debajo de un medio altamente aberrante como muestra de prueba para obtener imágenes. (b) Una imagen de microscopía de coherencia óptica convencional antes de la corrección de la aberración. (c) Una imagen con corrección de aberración obtenida usando la microscopía de matriz de reflexión. Crédito:IBS
Recientemente, un equipo de investigación dirigido por el profesor Choi Wonshik en el Centro de Espectroscopía y Dinámica Molecular dentro del Instituto de Ciencias Básicas (IBS) en Seúl, Corea del Sur logró un gran avance en la obtención de imágenes ópticas de tejido profundo. Desarrollaron un novedoso microscopio óptico que puede obtener imágenes a través del cráneo de un ratón intacto y adquirir un mapa microscópico de las redes neuronales en los tejidos cerebrales sin perder resolución espacial.
Este nuevo microscopio se denomina 'microscopio de matriz de reflexión, 'y combina los poderes del hardware y la óptica adaptativa computacional (AO), que es una tecnología desarrollada originalmente para la astronomía terrestre para corregir aberraciones ópticas. Mientras que un microscopio confocal convencional mide la señal de reflexión solo en el punto focal de iluminación y descarta toda la luz desenfocada, el microscopio de matriz de reflexión registra todos los fotones dispersos en posiciones distintas al punto focal. Los fotones dispersos luego se corrigen computacionalmente usando un algoritmo AO novedoso llamado acumulación de bucle cerrado de dispersión simple (CLASS), que el equipo desarrolló en 2017. El algoritmo explota toda la luz dispersa para extraer selectivamente la luz balística y corregir la aberración óptica severa. En comparación con la mayoría de los sistemas de microscopía AO convencionales, que requieren reflectores puntuales brillantes u objetos fluorescentes como estrellas guía de manera similar al uso de AO en astronomía, el microscopio de matriz de reflexión funciona sin ningún marcaje fluorescente y sin depender de las estructuras del objetivo. Además, el número de modos de aberración que se pueden corregir es más de 10 veces mayor que el de los sistemas AO convencionales.
El microscopio de matriz de reflexión tiene la gran ventaja de que se puede combinar directamente con un microscopio convencional de dos fotones que ya se utiliza ampliamente en el campo de las ciencias de la vida. Para eliminar la aberración experimentada por el haz de excitación del microscopio de dos fotones, El equipo implementó óptica adaptativa basada en hardware dentro del microscopio de matriz de reflexión para contrarrestar la aberración del cráneo del ratón. Mostraron las capacidades del nuevo microscopio al tomar imágenes de fluorescencia de dos fotones de una espina dendrítica de una neurona detrás del cráneo del ratón. con una resolución espacial cercana al límite de difracción. Normalmente, un microscopio convencional de dos fotones no puede resolver la delicada estructura de la columna dendrítica sin eliminar por completo el tejido cerebral del cráneo. Este es un logro muy significativo, como demostró el grupo de Corea del Sur la primera imagen de alta resolución de redes neuronales a través de un cráneo de ratón intacto. Esto significa que ahora es posible investigar el cerebro del ratón en sus estados más nativos.
[Figura 3-1] Imagen de reflectancia sin etiqueta de axones mielinizados en un cerebro de ratón a través del cráneo intacto (a) Muestra de cráneo y cerebro que se va a obtener la imagen. (b) Una imagen de reflectancia medida por el microscopio de coherencia óptica convencional. El grosor del cráneo era de aproximadamente 100 µm. (c) Imagen de alta resolución sin aberraciones obtenida por microscopía de matriz de reflexión. (d) Mapas de fase de aberraciones de frente de onda para pequeñas subregiones de la imagen encontradas por un nuevo algoritmo de corrección de aberraciones. [Figura 3-2] Demostración de corrección de aberraciones en imágenes de fluorescencia de dos fotones a través de un cráneo de ratón intacto. (a) y (b) Imágenes de fluorescencia de dos fotones de dendritas neuronales obtenidas a dos profundidades diferentes. (c) y (d) Imágenes después de corregir físicamente aberraciones por SLM. El grosor del cráneo intacto fue de aproximadamente 85 µm. Crédito:IBS
El profesor de investigación Yoon Seokchan y el estudiante de posgrado Lee Hojun, quién realizó el estudio, dijo, "Al corregir la distorsión del frente de onda, podemos enfocar la energía de la luz en la ubicación deseada dentro del tejido vivo ... Nuestro microscopio nos permite investigar estructuras internas finas en lo profundo de los tejidos vivos que no se pueden resolver por ningún otro medio. Esto nos ayudará enormemente en el diagnóstico temprano de enfermedades y agilizará la investigación en neurociencia ".
Los investigadores fijaron su próxima dirección de investigación para minimizar el factor de forma del microscopio y aumentar su velocidad de imagen. El objetivo es el desarrollo de un microscopio de matriz reflectante sin etiquetas con alta profundidad de imagen para uso en clínicas.
El subdirector Choi Wonshik dijo:"El microscopio de matriz de reflexión es la tecnología de próxima generación que va más allá de las limitaciones de los microscopios ópticos convencionales. Esto nos permitirá ampliar nuestra comprensión de la propagación de la luz a través de medios de dispersión y ampliar el alcance de las aplicaciones que un microscopio óptico puede explorar".
