Los científicos de EPFL han desarrollado imágenes de superresolución multicolor robustas y fáciles de implementar. El enfoque se basa en la adquisición simultánea de dos canales espectrales seguidos de análisis espectral de acumulación cruzada y desmezcla. Explotan el parpadeo del fluoróforo y la diafonía espectral para la generación de canales de color adicionales con imágenes superresueltas.

La microscopía de fluorescencia multicolor es una herramienta importante para que las ciencias de la vida estudien las disposiciones relativas de las estructuras celulares o las interacciones de diferentes proteínas. Sin embargo, microscopios convencionales, los caballos de batalla de muchos estudios biológicos, solo puede resolver detalles del orden de la longitud de onda de la luz. En las últimas dos décadas, Varios conceptos de microscopía de superresolución ayudaron a los investigadores a superar este límite de difracción y a realizar nuevos descubrimientos. Estos nuevos métodos se están abriendo camino lentamente hacia aplicaciones biológicas de rutina. Para algunas de las nuevas técnicas, esto se debe al complejo hardware del microscopio, pero también el aumento de la demanda en la preparación de muestras y las etiquetas fluorescentes plantean obstáculos importantes. Los requisitos para obtener imágenes de superresolución exitosas son aún más difíciles de cumplir para las aplicaciones multicolores.

El Laboratorio de Óptica Biomédica de EPFL, dirigido por Theo Lasser, ha estado trabajando extensamente en imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) para aumentar la resolución espacial y el muestreo en 2-D y 3-D. SOFI es una alternativa a las técnicas de microscopía de localización de una sola molécula como STORM y PALM. Analiza estadísticas espacio-temporales de orden superior de una serie temporal de fluoróforos parpadeantes y no requiere el aislamiento de emisiones de fluoróforos individuales. SOFI es compatible con una gama más amplia de condiciones de etiquetado e imagen, lo que simplifica la selección y los experimentos de fluoróforos. En su nuevo estudio, Investigadores de la Escuela de Ingeniería dirigida por Theo Lasser y Aleksandra Radenovic (jefa del Laboratorio de Biología a Nanoescala) extendieron el análisis estadístico al dominio espectral para allanar el camino hacia un nuevo enfoque para la obtención de imágenes de superresolución multicolor.

El número de colores no está limitado por los canales espectrales del microscopio o la explotación de la diafonía espectral

La idea detrás del enfoque SOFI multicolor es la siguiente. En las imágenes clásicas multicolores, debe evitarse la diafonía entre diferentes canales espectrales del microscopio. Aquí, los investigadores aprovechan la diafonía para generar canales de color adicionales. Aplican análisis de acumulación cruzada entre múltiples canales espectrales adquiridos simultáneamente. El análisis estadístico les permite complementar los canales de detección físicos proporcionados por el microscopio con canales espectrales virtuales adicionales. "Sólo las señales que están correlacionadas espacial y temporalmente en los diferentes canales espectrales aparecerán en los canales virtuales. Estamos captando exactamente la diafonía de la que todos los demás quieren deshacerse". explica Kristin Grußmayer, uno de los autores principales del estudio. Los canales espectrales adicionales generados computacionalmente junto con la desmezcla lineal permiten obtener imágenes de colores fluoróforos más distintos que los canales de detección física registrados.

La publicación proporciona la teoría detrás de SOFI multicolor de acumulación cruzada espectral e incluye un marco para optimizar los canales espectrales del microscopio para una combinación dada de fluoróforos que deben ser fotografiados. Los conjuntos de datos simulados ayudaron al equipo a verificar que su nuevo enfoque multicolor debería funcionar para una amplia gama de etiquetas con diferentes propiedades fotofísicas. incluso para aquellos con espectros de emisión fuertemente superpuestos. "Podríamos demostrar que nuestro enfoque funciona para imágenes de tres colores en células fijas y vivas para una variedad de tintes y proteínas fluorescentes. Las imágenes se pueden realizar utilizando configuraciones comerciales de campo amplio con unidades de división de imágenes de dos canales que están ampliamente disponibles. En principio , no estamos limitados a 3 colores ", dice Kristin Grußmayer.

Las instrucciones para realizar el análisis SOFI de acumulación cruzada espectral multicolor están disponibles en la página web del Laboratorio de biología a nanoescala en www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/ y el paquete de software se puede descargar en www.epfl.ch/ labs / lben / wp-content / uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip.