Un grupo de investigación dirigido por el profesor MATOBA Osamu (Organización para la Investigación Avanzada e Integrada) de la Universidad de Kobe ha creado con éxito imágenes de fase y fluorescencia 3-D de células vivas basadas en holografía digital. Utilizaron células vegetales con marcadores de proteínas fluorescentes en sus núcleos para demostrar este sistema de imágenes.

El grupo estaba formado por el profesor asistente del proyecto Manoj KUMAR y el profesor asistente Xiangyu QUAN (ambos de la Escuela de Graduados en Informática de Sistemas), Profesor AWATSUJI Yasuhiro (Instituto de Tecnología de Kyoto) y Profesor Asociado TAMADA Yosuke (Universidad de Utsunomiya).

Esta tecnología formará una base para la obtención de imágenes de células vivas, que es indispensable en el campo de las ciencias de la vida. También se espera que el uso de esta tecnología para visualizar los procesos de las células madre en las plantas aumente nuestra comprensión de las mismas.

Estos resultados de investigación aparecieron en la revista Informes científicos , publicado por Springer Nature el 15 de mayo.

Antecedentes de la investigación

El microscopio óptico se inventó a finales del siglo XVI y el científico británico Robert Hooke fue el primero en descubrir células a mediados del siglo XVII. La invención se ha desarrollado en nuevas tecnologías como el microscopio de contraste de fase (Premio Nobel de Física de 1953), que permite observar las células vivas sin necesidad de teñirlas, e imágenes celulares fluorescentes, en el que se marcan moléculas específicas utilizando proteínas fluorescentes (Premio Nobel de Química 2008) y se observan en células vivas. Estos se han convertido en herramientas esenciales para la observación en los campos de las ciencias de la vida y la medicina.

Las imágenes de fase utilizan la diferencia en la longitud óptica de la luz a medida que pasa a través de una muestra biológica para revelar información estructural sobre ella. Las imágenes de fluorescencia proporcionan información sobre moléculas específicas dentro de la muestra biológica, y puede revelar sus funciones. Sin embargo, la estructura intracelular y la motilidad son complejas. La capacidad de visualizar información física multidimensional que comprenda imágenes de fase y fluorescencia sería útil para comprender estos aspectos. Un sistema de imágenes que pudiera generar información física variada de forma simultánea e instantánea a partir de células vivas tridimensionales serviría como tecnología de base para generar innovación en biología.

El sistema híbrido de imágenes multimodal construido en este estudio puede obtener información tridimensional fluorescente y de fase en una sola toma. Permite a los investigadores visualizar cuantitativa y simultáneamente la información estructural o funcional de una muestra biológica utilizando una única plataforma.

Metodología de investigación

En este estudio, los investigadores construyeron un microscopio holográfico digital multimodal que podía registrar la información fluorescente de una muestra y la información de fase simultáneamente (Figura 1). Esto utiliza la holografía digital como base, mediante el cual se registra la información de luz interferida del objeto y luego se utilizan cálculos ópticos realizados por computadora para generar información espacial en 3-D sobre el objeto.

El microscopio del estudio está compuesto por dos sistemas ópticos diferentes. Primeramente, el sistema de imágenes de fluorescencia holográfica 3-D, como se muestra en el lado derecho de la Figura 1. Para obtener la información de fluorescencia 3-D, Se utiliza un modulador de luz espacial para dividir la luz fluorescente emitida por moléculas fluorescentes en dos ondas de luz que pueden interferir entre sí.

En este punto, la información tridimensional de la luz del objeto se conserva dando a una de las ondas de luz un radio de curvatura y una dirección de propagación ligeramente diferentes; al mismo tiempo, las dos ondas de luz están en una vía óptica compartida (en su mayoría avanzando a lo largo del mismo eje) lo que permite tomar una medición de interferencia temporalmente estable. Este sistema óptico fue formulado en este estudio, aclarando la distribución de la intensidad de interferencia registrada por primera vez. Esta fórmula permitió a los investigadores encontrar condiciones experimentales que mejorarían la calidad de las imágenes fluorescentes reconstruidas. Pudieron generar imágenes tridimensionales de células vivas y sus estructuras mediante la aplicación de este sistema holográfico tridimensional fluorescente. Las moléculas y estructuras de las células vivas se marcaron con proteínas fluorescentes, permitiendo observar sus comportamientos dinámicos a través de esta nueva microscopía de fluorescencia 3-D.

La tecnología de imágenes desarrollada por este estudio permite imágenes 3-D, que hasta ahora han tardado comparativamente más en generar mediante escaneo láser, para ser generados en una sola toma sin necesidad de escanear.

Próximo, como se muestra a la izquierda de la Figura 1, es el sistema holográfico de imágenes de fase tridimensional. Una célula vegetal viva está formada por componentes como un núcleo, mitocondrias, cloroplastos, y una pared celular delgada. Es posible visualizar las estructuras de estos componentes a partir de las diferencias de fase (longitud del camino óptico). En este sistema, la adopción del interferómetro Mach-Zehnder permite utilizar la onda plana de referencia, permitiendo obtener fácilmente la franja de interferencia óptima para cada objeto medido.

Este microscopio holográfico digital fue creado unificando sistemas de medición de fase y fluorescencia.

Después, este microscopio se utilizó para visualizar células vegetales vivas. Se llevó a cabo un experimento para demostrar que es posible realizar observaciones 4-D aplicando 3-D espacial y un eje de tiempo (unidimensional). Se utilizaron el musgo Physcomitrella patens y perlas fluorescentes con un tamaño medio de 10 μm. Las Figuras 2 y 3 muestran los resultados del experimento para imágenes de fase y fluorescencia 3D simultáneas del musgo. La Figura 2 (b) muestra que siete núcleos son visibles cuando se usa un microscopio de fluorescencia de campo completo convencional. De estos siete, los núcleos numerados 1, 2, y 4 están enfocados, sin embargo, este no es el caso de los núcleos en ubicaciones a diferentes profundidades, ya que es una imagen fluorescente débil con un desenfoque generalizado. En la metodología propuesta por este estudio para resolver este problema, La información de ondas de luz fluorescente se extrajo del holograma fluorescente en la Figura 2 (c). Basado en esta información, el algoritmo de propagación numérico de Fresnel puede obtener imágenes fluorescentes reconstruidas a cualquier profundidad o distancia. Por lo tanto, Las imágenes enfocadas de múltiples núcleos fluorescentes a diferentes profundidades se restauraron a partir de una sola imagen sin escaneo.

Figura 2 (d), (mi), y (f) mostrar las imágenes reconstruidas en tres planos diferentes. La distancia axial entre (d) y (e) es de 10 micrómetros, y 15 micrómetros entre (e) y (f). Las flechas amarillas indican los núcleos que están enfocados. Es posible ver cuál de los siete núcleos de la imagen de fluorescencia está enfocado en los tres planos.

La Figura 3 muestra la distribución de fase cuantitativa para los tres planos a diferentes profundidades. Fue posible visualizar cloroplastos individuales (hay muchos alrededor de los bordes de las células, como lo indican los picos rojos en la Figura 3 (b)). El grosor de la celda, calculado a partir de los valores de fase cuantitativos medidos, era de unos 17 micrómetros, un tamaño muy cercano a otros valores de referencia.

En la Figura 4, puede ver perlas fluorescentes (de aproximadamente 10 micrómetros de tamaño) flotando en una solución. La información de fase y fluorescencia se generó a partir de grabaciones utilizando la metodología propuesta. Las cuentas también se mueven en la dirección de la profundidad, por lo que es posible recuperar su posición tridimensional cambiando la distancia de reconstrucción para mantenerlos enfocados.

En este estudio, se desarrolló un microscopio holográfico digital multimodal, capaz de realizar mediciones simultáneas de fluorescencia y fase tridimensional. Con la capacidad de realizar imágenes de fluorescencia y fase cuantitativa al mismo tiempo, se cree que este método servirá como una nueva tecnología de base para la visualización de células y tejidos biológicos vivos. En particular, Se ha demostrado que este microscopio se puede aplicar a células vegetales complejas. Podría utilizarse para obtener una comprensión diversificada del proceso de formación de células madre en las plantas, que se reproducen más fácilmente que las células animales. En el futuro, Puede ser posible utilizar esta información para controlar el proceso de las células madre mediante la estimulación por luz. La reproducción y el crecimiento eficientes de las plantas logrados a través de las imágenes propuestas y la estimulación futura podrían aplicarse al desarrollo de un sistema de cultivo de alimentos.

Esta tecnología podría desarrollarse mejorando aún más la eficiencia del uso de la luz. En holografía digital, es necesario ampliar espacialmente el diámetro del haz, dividirlo en dos, y luego superpóngalos nuevamente para usar la interferencia entre los dos caminos de luz. Por lo tanto, también es necesario aumentar la energía fluorescente para que sea observada por el sensor de imagen. Para lograr esto, se necesitaría una gran cantidad de energía luminosa para iluminar las células vivas, sin embargo, El daño celular causado por la luz sería un gran problema. Se cree que podría usarse un holograma de volumen para aumentar la eficiencia del uso de la luz y evitar la fototoxicidad celular.

Otro problema es que la distribución tridimensional reconstruida se extiende en la dirección de propagación de la luz (la dirección de profundidad del objeto), disminución de la resolución axial. Los investigadores están trabajando en métodos que utilizan el aprendizaje profundo y el filtrado para suprimir esta extensión en la dirección de profundidad y mejorar la calidad de la imagen.