Investigadores de la Unidad QWM, El Dr. Hidehito Adaniya (izquierda) y el Dr. Martin Cheung (derecha) muestran el nuevo microscopio crioelectrónico. Crédito:Instituto de Ciencia y Tecnología de Okinawa
Visualizando la estructura de los virus, Las proteínas y otras biomoléculas pequeñas pueden ayudar a los científicos a obtener conocimientos más profundos sobre cómo funcionan estas moléculas. potencialmente conduciendo a nuevos tratamientos para la enfermedad. En años recientes, una poderosa tecnología llamada microscopía electrónica criogénica (cryo-EM), donde las muestras congeladas instantáneamente se incrustan en hielo similar al vidrio y se sondean con un haz de electrones, ha revolucionado la obtención de imágenes de biomoléculas. Sin embargo, los microscopios en los que se basa la técnica son prohibitivamente caros y complicados de usar, haciéndolos inaccesibles para muchos investigadores.
Ahora, Científicos de la Universidad de Graduados del Instituto de Ciencia y Tecnología de Okinawa (OIST) han desarrollado un microscopio crioelectrónico más económico y fácil de usar. lo que, en última instancia, podría poner a cryo-EM al alcance de miles de laboratorios.
En un proceso de construcción de seis años, el equipo construyó el microscopio agregando una nueva función de imagen a un microscopio electrónico de barrido. Utilizaron el microscopio híbrido para obtener imágenes de tres biomoléculas diferentes:dos virus de formas distintas y una proteína de lombriz de tierra.
"La construcción de este microscopio fue un proceso largo y desafiante, por lo que estamos encantados con sus resultados hasta ahora, "dijo el Dr. Hidehito Adaniya, investigador de la Unidad de Microscopía de Ondas Cuánticas (QWM) y coautor del estudio, publicado en Ultramicroscopía . "Además de ser más económico y sencillo de usar, nuestro microscopio utiliza electrones de baja energía, lo que podría mejorar potencialmente el contraste de las imágenes ".
En la actualidad, cryo-EM funciona disparando electrones de alta energía a una muestra biológica. Los electrones interactúan con los átomos de la biomolécula y se dispersan, cambiando su dirección. Los electrones dispersos luego golpean los detectores, y el patrón de dispersión específico se usa para construir una imagen de la muestra.
Los dos modos convencionales de un microscopio electrónico de barrido (SEM y STEM; izquierda y centro) no pudieron generar imágenes de las biomoléculas. Sin embargo, modo de imagen holográfica (derecha), se puede utilizar para obtener imágenes de biomoléculas, como el virus del mosaico del tabaco que se muestra. Crédito:Modificado de M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imágenes holográficas de electrones en línea de baja energía de biomoléculas pequeñas incrustadas en hielo vítreo utilizando un microscopio electrónico de barrido modificado. Ultramicroscopía, 209 (2020) 112883, Fig. 3.
Pero a altas energías, sólo un número relativamente pequeño de estos eventos de dispersión ocurre porque los electrones interactúan muy débilmente con los átomos de la muestra a medida que pasan rápidamente.
"Las biomoléculas están compuestas predominantemente por elementos con una masa atómica baja, como el carbono, nitrógeno, hidrógeno y oxígeno, "explicó el coautor e investigador, Dr. Martin Cheung. "Estos elementos más ligeros son prácticamente invisibles para los electrones de alta velocidad".
A diferencia de, los electrones de baja energía viajan más lentamente e interactúan más fuertemente con los elementos más ligeros, creando eventos de dispersión más frecuentes.
Esta fuerte interacción entre electrones de baja energía y elementos más ligeros es un desafío para aprovechar, sin embargo, porque la capa de hielo que rodea al espécimen también dispersa electrones, creando ruido de fondo que enmascara las biomoléculas. Para superar este problema, los científicos adaptaron el microscopio para que pudiera cambiar a una técnica de imagen diferente:la holografía crioelectrónica.
En el modo de imagen holográfica, el haz de electrones abarca toda la muestra, formando una onda de referencia y una onda de objeto. Estas ondas luego interfieren entre sí para formar un holograma, que es registrado por un detector. Crédito:Modificado de M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imágenes holográficas de electrones en línea de baja energía de biomoléculas pequeñas incrustadas en hielo vítreo utilizando un microscopio electrónico de barrido modificado. Ultramicroscopía, 209 (2020) 112883, Figura 2.
Formando el holograma
En modo holográfico, un cañón de electrones dispara un haz de electrones de baja energía hacia la muestra de modo que parte del haz de electrones pasa a través del hielo y la muestra, formando una onda de objeto, mientras que la otra parte del haz de electrones solo atraviesa el hielo, formando una onda de referencia. Las dos partes del haz de electrones interactúan entre sí, como ondas que chocan en un estanque, creando un patrón distintivo de interferencia:el holograma.
Basado en el patrón de interferencia del holograma, los detectores pueden distinguir la dispersión de la muestra de la dispersión de la película de hielo. Los científicos también pueden comparar las dos partes del haz para obtener información adicional de los electrones que es difícil de detectar usando crio-EM convencional.
"La holografía electrónica nos proporciona dos tipos diferentes de información:amplitud y fase, mientras que las técnicas convencionales de microscopía crioelectrónica solo pueden detectar la fase, ", dijo el Dr. Adaniya. Esta información adicional podría permitir a los científicos obtener más conocimientos sobre la estructura del espécimen, él explicó.
El hielo cristalino se forma cuando el vapor de agua atmosférico se enfría y cristaliza al entrar en contacto con la muestra superenfriada. Por lo tanto, los investigadores deben realizar el procedimiento de preparación en una caja de guantes llena de nitrógeno para evitar cualquier contacto con el agua. Crédito:Instituto de Ciencia y Tecnología de Okinawa
Un gran avance en hielo fino
Además de construir el microscopio híbrido, los científicos también tuvieron que optimizar la preparación de la muestra. Dado que los electrones de baja energía son más propensos a ser dispersados por el hielo que los electrones de alta energía, la película de hielo que envuelve la muestra tenía que ser lo más fina posible para maximizar la señal. Los científicos utilizaron escamas de óxido de grafeno hidratado para mantener las biomoléculas en su lugar. permitiendo que se formen películas más delgadas de hielo.
Los científicos también tuvieron que tomar medidas especiales para evitar la formación de hielo cristalino. que son "malas noticias para las imágenes crio-EM, "Dijo Cheung.
Con la configuración actual y las muestras optimizadas, el microscopio produjo imágenes con una resolución de hasta unos pocos nanómetros, que los investigadores reconocen es mucho más baja que la resolución casi atómica lograda por la crio-EM convencional.
Pero incluso con la resolución actual, el microscopio todavía ocupa un nicho importante como microscopio de preselección. "Debido a que los electrones de baja energía interactúan tan fuertemente con el hielo, Nuestro microscopio más económico y fácil de usar puede ayudar a los investigadores a medir la calidad del hielo antes de invertir tiempo y dinero valiosos en el uso de microscopios crio-EM convencionales. "dijo el Dr. Adaniya.
Todo el proceso es rápido y sencillo, dicen los investigadores. El modo SEM / STEM ayuda a los científicos a localizar el mejor lugar para obtener imágenes, seguido de una transición perfecta al modo holográfico. Y lo que es más, la posibilidad de que esta tecnología de cambio de modo se implemente en otros microscopios electrónicos de barrido comerciales lo convierte en un método de obtención de imágenes de amplia adopción.
En el futuro, el equipo espera mejorar aún más la resolución de la imagen, cambiando el cañón de electrones por uno que cree un haz de electrones de mayor calidad. "Ese será el siguiente paso adelante, " ellos dijeron.
