Los científicos de la Universidad de Würzburg han podido impulsar la microscopía de superresolución actual mediante un nuevo ajuste. Cubrieron el cubreobjetos de vidrio como parte del portamuestras con nanohojas biocompatibles hechas a medida que crean un efecto de espejo. Este método muestra que la localización de emisores individuales frente a un recubrimiento de dieléctrico metálico conduce a una mayor precisión, brillo y contraste en microscopía de localización de molécula única (SMLM). El estudio fue publicado en la Naturaleza diario Luz:ciencia y aplicaciones .

La nitidez de un microscopio óptico está limitada por las condiciones físicas:estructuras que están más juntas que 0,2 milésimas de un milímetro de borrosidad, y ya no se pueden distinguir entre sí. La causa de este desenfoque es la difracción. Por lo tanto, cada objeto en forma de punto no se muestra como un punto, pero como una mancha borrosa.

Con métodos matemáticos, la resolución aún se puede mejorar drásticamente. Un método calcularía su centro exacto a partir de la distribución de brillo del punto borroso. Sin embargo, solo funciona si dos puntos muy adyacentes del objeto no son inicialmente simultáneamente, pero posteriormente visibles, y se fusionan más tarde en el procesamiento de imágenes. Este desacoplamiento temporal evita la superposición de la mancha borrosa. Durante años, Los investigadores en ciencias de la vida han estado utilizando este método complicado para microscopía de luz de células de súper alta resolución.

Uno de estos métodos fue desarrollado por el grupo de investigación del Prof. Dr. Markus Sauer de la Universidad de Würzburg:microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM). Esta poderosa técnica SMLM puede proporcionar una resolución lateral de ~ 20 nm. Para este propósito, ciertas estructuras, por ejemplo, poros de un núcleo celular, se tiñen con tintes fluorescentes. Cada una de las moléculas de tinte parpadea a intervalos irregulares y representa parte del poro. Por tanto, la imagen de los poros nucleares no es inicialmente visible, pero surge después del procesamiento de la imagen por la superposición de varios miles de imágenes. Con la técnica dSTORM, la resolución de un microscopio óptico convencional se puede incrementar en un factor de 10. "Nos permite visualizar la arquitectura de una célula hasta su nivel molecular, por ejemplo, "explica Hannah Heil. La investigadora está haciendo su doctorado en el Centro Rudolf Virchow de la Universidad de Würzburg en el grupo de la Prof. Katrin Heinze.

Sin embargo, las estadísticas de fotones definen un límite de resolución virtual en resolución. Para abordar este asunto, Katrin Heinze tuvo la idea de utilizar nano revestimientos biocompatibles relativamente simples para aumentar la señal. En un esfuerzo conjunto con Markus Sauer y colegas de la facultad de Física, Hannah Heil diseñó y fabricó nano revestimientos dieléctricos de metal que se comportan como un espejo sintonizable. Casi duplica la resolución.

Espejo, espejo en la pared:¿Qué imagen es la más nítida de todas?

Durante la observación, colocaron las células en un cubreobjetos depositado al vapor con un nano-revestimiento reflectante delgado que consiste en plata y nitrito de silicio transparente. El revestimiento es biocompatible, para que no dañe la celda. Con este método, los dos grupos lograron dos efectos:el espejo reflejaba la luz emitida al microscopio, lo que aumentó el brillo de la señal de fluorescencia y, por lo tanto, también la nitidez efectiva de la imagen.

Segundo, las ondas de luz emitidas y reflejadas se superponen. Esto crea las llamadas interferencias. Dependiendo de la distancia al espejo, la luz se amplifica o atenúa. "De este modo, principalmente vemos estructuras en un cierto plano de imagen, ", dice Heil." Todo lo que está arriba o abajo y podría perturbar la imagen es, por otra parte, oculto ". Para asegurarse de que las partes exactas de la imagen sean visibles, el grosor de la capa transparente aplicada al espejo debe elegirse adecuadamente. Entre otras cosas, Heinze y Heil usan simulaciones por computadora para adaptar el revestimiento de acuerdo con el objeto.

En general, el método es sorprendentemente fácil de usar, dice Hannah Heil. "Eso es lo que realmente me gusta de nuestro enfoque". El profesor Heinze agrega:"Excepto por el barato cubreobjetos recubierto de dieléctrico metálico, no hay necesidad de ningún hardware o software de microscopio adicional para aumentar la precisión de la localización, y por lo tanto es un complemento fantástico en microscopía avanzada ".