Un equipo internacional de científicos ha utilizado por primera vez un láser de rayos X de electrones libres para desentrañar la estructura de una partícula de virus intacta a nivel atómico. El método utilizado reduce drásticamente la cantidad de material viral requerido, al mismo tiempo que permite que las investigaciones se lleven a cabo varias veces más rápido que antes. Esto abre oportunidades de investigación completamente nuevas, como informa el equipo de investigación dirigido por el científico de DESY Alke Meents en la revista Métodos de la naturaleza .

En el campo conocido como biología estructural, Los científicos examinan la estructura tridimensional de las moléculas biológicas para determinar cómo funcionan. Este conocimiento mejora nuestra comprensión de los procesos biológicos fundamentales que tienen lugar dentro de los organismos, como la forma en que las sustancias se transportan dentro y fuera de una célula, y también se puede utilizar para desarrollar nuevos fármacos.

"Conocer la estructura tridimensional de una molécula como una proteína brinda una gran comprensión de su comportamiento biológico, "explica el coautor David Stuart, Director de Ciencias de la Vida en la instalación de sincrotrón Diamond Light Source en el Reino Unido y profesor de la Universidad de Oxford. "Un ejemplo es cómo comprender la estructura de una proteína que usa un virus para 'engancharse' a una célula podría significar que podemos diseñar una defensa para que la célula haga que el virus sea incapaz de atacarla".

La cristalografía de rayos X es, con mucho, la herramienta más prolífica utilizada por los biólogos estructurales y ya ha revelado las estructuras de miles de moléculas biológicas. Se cultivan pequeños cristales de la proteína de interés, y luego iluminado con rayos X de alta energía. Los cristales difractan los rayos X de manera característica, de modo que los patrones de difracción resultantes se pueden utilizar para deducir la estructura espacial del cristal, y por lo tanto de sus componentes, a escala atómica. Sin embargo, Los cristales de proteína no son tan estables y resistentes como los cristales de sal, por ejemplo. Son difíciles de cultivar a menudo quedando diminuto, y se dañan fácilmente con los rayos X.

"Los láseres de rayos X han abierto un nuevo camino hacia la cristalografía de proteínas, debido a que sus pulsos extremadamente intensos pueden usarse para analizar incluso cristales extremadamente pequeños que no producirían una imagen de difracción suficientemente brillante usando otras fuentes de rayos X, "añade el coautor Armin Wagner de Diamond Light Source. Sin embargo, cada uno de estos microcristales solo puede producir una única imagen de difracción antes de que se evapore como resultado del pulso de rayos X. Para realizar el análisis estructural, aunque, Se necesitan cientos o incluso miles de imágenes de difracción. En tales experimentos, Por lo tanto, los científicos inyectan un fino chorro líquido de cristales de proteínas a través de un láser de rayos X pulsado, que libera una secuencia rápida de ráfagas extremadamente cortas. Cada vez que un pulso de rayos X golpea un microcristal, se produce y registra una imagen de difracción.

Este método tiene mucho éxito y ya se ha utilizado para determinar la estructura de más de 80 biomoléculas. Sin embargo, la mayor parte del material de muestra se desperdicia. "La tasa de aciertos suele ser inferior al dos por ciento de los pulsos, por lo que la mayoría de los preciosos microcristales terminan sin usarse en el recipiente de recolección, "dice Meents, que tiene su sede en el Centro de Ciencia Láser de Electrones Libres (CFEL) en Hamburgo, una cooperación de DESY, la Universidad de Hamburgo y la Sociedad Alemana Max Planck. Por lo tanto, el método estándar generalmente requiere varias horas de tiempo de haz y cantidades significativas de material de muestra.

Para utilizar el tiempo de haz limitado y el preciado material de muestra de manera más eficiente, el equipo desarrolló un nuevo método. Los científicos utilizan un chip de micropatrón que contiene miles de poros diminutos para contener los cristales de proteína. El láser de rayos X luego escanea el chip línea por línea, e idealmente esto permite que se registre una imagen de difracción para cada pulso del láser.

El equipo de investigación probó su método en dos muestras de virus diferentes utilizando el láser de rayos X LCLS en el Laboratorio Nacional Acelerador SLAC en los EE. UU. que produce 120 pulsos por segundo. Cargaron su portamuestras con una pequeña cantidad de microcristales del enterovirus bovino 2 (BEV2), un virus que puede provocar abortos espontáneos, mortinatos, e infertilidad en el ganado, y que es muy difícil de cristalizar.

En este experimento, los científicos lograron una tasa de aciertos, donde el láser de rayos X apuntó con éxito al cristal, de hasta el nueve por ciento. En solo 14 minutos, habían recopilado suficientes datos para determinar la estructura correcta del virus, que ya se conocía a partir de experimentos en otras fuentes de luz de rayos X, hasta una escala de 0,23 nanómetros (millonésimas de milímetro).

"A lo mejor de nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se determina la estructura atómica de una partícula de virus intacta utilizando un láser de rayos X, "Meents señala." Mientras que los métodos anteriores en otras fuentes de luz de rayos X requerían cristales con un volumen total de 3,5 nanolitros, logramos usar cristales que eran diez veces más pequeños, con un volumen total de solo 0,23 nanolitros ".

Este experimento se realizó a temperatura ambiente. Si bien enfriar los cristales de proteína los protegería hasta cierto punto del daño por radiación, esto generalmente no es factible cuando se trabaja con cristales de virus extremadamente sensibles. Los cristales de proteínas virales aisladas pueden, sin embargo, estar congelado, y en una segunda prueba, los investigadores estudiaron la proteína viral polihedrina que forma un cuerpo de oclusión viral para varios miles de partículas de virus de ciertas especies. Las partículas de virus utilizan estos contenedores para protegerse contra las influencias ambientales y, por lo tanto, pueden permanecer intactas durante mucho más tiempo.

Para la segunda prueba, el científico cargó su chip con cristales de poliedrina y los examinó usando el láser de rayos X mientras mantenía el chip a temperaturas por debajo de menos 180 grados Celsius. Aquí, los científicos lograron una tasa de aciertos de hasta el 90 por ciento. En solo diez minutos habían registrado imágenes de difracción más que suficientes para determinar la estructura de la proteína con una precisión de 0,24 nanómetros. "Para la estructura de poliedrina, solo tuvimos que escanear un solo chip que estaba cargado con cuatro microgramos de cristales de proteína; es decir, órdenes de magnitud menos que la cantidad que normalmente se necesitaría, "explica Meents.

"Nuestro enfoque no solo reduce el tiempo de recopilación de datos y la cantidad de muestra necesaria, también abre la oportunidad de analizar virus completos utilizando láseres de rayos X, "Meents resume. Los científicos ahora quieren aumentar la capacidad de su chip en un factor de diez, desde 22, 500 a unos 200, 000 microporos, y aumente aún más la velocidad de escaneo hasta mil muestras por segundo. Esto aprovecharía mejor el potencial del nuevo láser europeo de rayos X de electrones libres XFEL, que acaba de entrar en funcionamiento en la región de Hamburgo y que podrá producir hasta 27, 000 pulsos por segundo. Es más, la próxima generación de chips solo expondrá aquellos microporos que se están analizando actualmente, para evitar que los cristales restantes se dañen por la radiación dispersa del láser de rayos X.

Investigadores de la Universidad de Oxford, la Universidad de Finlandia Oriental, el Instituto suizo Paul Scherrer, el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley en los Estados Unidos y SLAC también participaron en la investigación. Los científicos de diamantes han colaborado con el equipo de DESY, con gran parte del desarrollo y las pruebas del chip de micropatrón que se realiza en las líneas de luz I02 e I24 de Diamond.