Un método novedoso para mejorar el alto rendimiento, alta pureza, La purificación de alta actividad de proteínas complejas de 10 a 500 veces se ha desarrollado en la Universidad de Alabama en Birmingham.

"Este nuevo método ofrece una serie de ventajas cruciales tanto para los investigadores como para la industria farmacéutica, "dijo Dmitry Vassylyev, Catedrático de Bioquímica y Genética Molecular de la UAB. "Es potencialmente la herramienta más eficiente y universal para estudios de alto rendimiento de muchos sistemas biológicos importantes y puede ayudar a la producción a gran escala de proteínas terapéuticas".

Alto rendimiento, alta pureza, purificación de alta actividad, o HHH, es el Santo Grial para aplicaciones estructurales e industriales. El esquema de purificación de un solo paso de la UAB supera las debilidades significativas de los sistemas de purificación disponibles comercialmente actuales, Dice Vassylyev.

En un artículo publicado en procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias , Vassylyev y sus colegas de la UAB probaron su método de purificación por cromatografía de afinidad CL7 / Im7 en cinco moléculas biológicas tradicionalmente desafiantes, incluyendo proteínas de membrana procariotas y eucariotas y proteínas de unión a ADN / ARN de múltiples subunidades.

"Una ilustración notable del rendimiento superior del enfoque CL7 / Im7, "escribieron en el informe PNAS, "es que la muestra de proteína CNX, que purificamos en unas pocas horas y de solo unos pocos gramos de células de E. coli, tendría un valor de mercado de aproximadamente $ 400, 000, según los precios comerciales vigentes ".

El sistema es sencillo y reutilizable:los investigadores de la UAB han restaurado y reutilizado su columna de cromatografía de afinidad más de 100 veces. manteniendo casi el 100 por ciento de la capacidad de unión.

El método se basa en la afinidad de unión notablemente fuerte entre las toxinas bacterianas llamadas colicinas y sus proteínas inmunitarias específicas. Una bacteria huésped puede liberar una toxina colicina, como Colicin E7 DNAse, que es capaz de matar otras bacterias. Dentro de la bacteria huésped, el CE7 está unido a la proteína inmunitaria 7, o Im7; esta unión evita la destrucción autoinfligida.

La afinidad de unión de CE7 / Im7 es casi tan fuerte como un enlace covalente, y es de cuatro a siete órdenes de magnitud mayor que otros análogos de cromatografía de afinidad. Vassylyev y sus colegas hicieron una variante inactiva de CE7, llamado CL7, que no tiene actividad DNasa pero conserva la afinidad de unión completa por Im7. También hicieron una variante de Im7 que permite un acoplamiento eficiente a perlas de agarosa.

Usando técnicas genéticas, la etiqueta CL7 se inserta fácilmente en genes de proteínas diana, tanto en eucariotas como en procariotas. Estos genes pueden trasladarse a un vector de expresión, o la proteína diana marcada puede expresarse a partir de células nativas sin amplificación.

Cuando se vierte un lisado de proteína cruda a través de una columna llena de perlas de agarosa Im7, las etiquetas CL7 de la proteína diana se unen a Im7. Se usa un sitio de proteasa diseñado para liberar la proteína diana de la etiqueta CL7 unida. Esto permite la purificación de HHH en un solo paso, con una pureza del 97 al 100 por ciento, para las proteínas diana ensayadas por los investigadores de la UAB.

A diferencia de, La mayoría de los esquemas de purificación publicados para estas proteínas desafiantes son de varios pasos, protocolos de varios días, con menores rendimientos. Vassylyev, un cristalógrafo de proteínas, dice que obtener grandes cantidades de proteína pura es el paso que limita la velocidad en la cristalografía, lo que lo impulsó a comenzar la búsqueda de un método mejor hace cuatro años.

Las proteínas desafiantes purificadas en el informe PNAS fueron la ARN polimerasa bacteriana Thermus thermophilus y la ARN polimerasa de Mycobacteria tuberculosis. que son proteínas de múltiples subunidades; Integrasa de membrana YidC, una proteína de membrana de Bacillus halodurans; calnexina, o CNX, una proteína chaperona transmembrana humana; y dos proteínas de unión a ácidos nucleicos, el complejo proteico de condensina de múltiples subunidades de Salmonella typhimurium que pliega y compacta el ADN celular, y el complejo de factores de espaciamiento y remodelación humana, RSF, que está implicado en mediar el ensamblaje de nucleosomas.

El sistema de purificación simple también es aplicable a experimentos de extracción y actividad cinética o ensayos de unión, como la resonancia de plasmón superficial. También puede ayudar a la microscopía crioelectrónica.