Configuración de RMN de prepolarización de microfluidos. (A) Comparación de polarización estadística y térmica de protones en agua en función del volumen de detección. La densidad de protones del agua a temperatura ambiente es ρ =6,7 × 1028 m − 3. (B) Concepto de prepolarización. El analito se prepolariza haciéndolo pasar a través de un imán permanente (matriz Halbach de 1,5 T). Posteriormente se transporta a un chip de microfluidos alojado en un estabilizado, campo magnético inferior (B0 =13 mT, Bobinas de Helmholtz) donde es detectado por NV NMR. (C) Configuración de detección. El analito prepolarizado fluye a un chip de microfluidos donde se detiene mediante interruptores fluídicos (no se muestra), y la señal NV NMR se detecta usando un microscopio de epifluorescencia hecho a medida con una apertura numérica (NA) de ∼0,8. Se utiliza un conjunto de ocho bobinas de compensación de gradiente para eliminar gradientes de campo magnético de primer y segundo orden a lo largo de la dirección del campo. El campo se estabiliza temporalmente utilizando un magnetómetro de RMN basado en bobinas en combinación con bobinas de retroalimentación de baja inductancia enrolladas alrededor de las bobinas principales de Helmholtz. (D) Configuración del chip microfluídico. El chip está construido con vidrio y adhesivos. Dos líneas fluídicas pasan a la región de detección, uno compuesto de agua (para magnetómetro de bobina de RMN) y el otro con analito (para RMN de NV). Un bucle de excitación de radiofrecuencia (RF), colocado entre el magnetómetro de bobina de RMN y el sensor de RMN NV, excita la coherencia de espín nuclear en ambos canales. El magnetómetro de bobina de RMN consiste en una bobina de 3 mm de diámetro enrollada alrededor de un volumen de agua de ~ 10 μl. El bucle de excitación de RF y el magnetómetro de bobina de RMN se colocaron ortogonales entre sí para minimizar la diafonía. Líneas de microondas de cobre (MW), impreso en el interior del chip de vidrio, proporcionan control de giro sobre los espines de electrones NV. (E) Geometría NV NMR. Una membrana de diamante dopada con NV (1 mm por 1 mm por 0,035 mm) se encuentra en la superficie de un canal de microfluidos (ancho:2 mm, altura:entre 0,2 mm y 1 mm) en contacto con el analito. La iluminación láser (532 nm) rebota en la línea de microondas impresa, y se detecta fluorescencia (650 a 800 nm). El volumen efectivo de detección de analitos es de ∼40 pL. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895
Los sensores cuánticos basados en centros de vacantes de nitrógeno (NV) en diamante son un modo de detección prometedor para la espectroscopia de resonancia magnética nuclear debido a su volumen de detección a escala micrométrica y los requisitos de detección de muestras no inductivos. Un desafío que existe es lograr suficientemente una alta resolución espectral junto con una sensibilidad a la concentración para el análisis de RMN multidimensional de volúmenes de muestra de picolitros. En un nuevo informe ahora en Avances de la ciencia , Janis Smits y un equipo de investigación interdisciplinario en los departamentos de Materiales de Alta Tecnología, La física y la astronomía en los EE. UU. Y Letonia abordaron el desafío separando espacialmente las fases de polarización y detección del experimento en una plataforma de microfluidos.
Se dieron cuenta de una resolución espectral de 0,65 ± 0,05 Hz, una mejora de un orden de magnitud en comparación con estudios anteriores de RMN de diamante. Usando la plataforma, realizaron espectroscopía de correlación 2-D de analitos líquidos con un volumen de detección efectivo de ~ 40 picolitros. El equipo de investigación utilizó sensores cuánticos de diamante como detectores de RMN de microfluidos en línea en un gran paso adelante para aplicaciones en análisis químico de masa limitada y biología unicelular.
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica poderosa y bien establecida para la composición, análisis estructural y funcional en una variedad de disciplinas científicas. En la espectrometría de RMN convencional, la relación señal / ruido (SNR) depende en gran medida de la intensidad del campo externo (B 0 ). A medida que aumentaba la resolución espectral, El b 0 aumentado también, Motivar el desarrollo de imanes superconductores cada vez más grandes y costosos para mejorar la resolución y la SNR. resultando en un aumento de dos veces en la intensidad de campo en los últimos 25 años.
Sin embargo, incluso con gran B 0 valores, la detección de volúmenes a microescala a menudo requería un etiquetado isotópico, muestras concentradas y largos plazos experimentales. Para mejorar la sensibilidad para pequeños volúmenes de muestra, los investigadores desarrollaron bobinas inductivas en miniatura, lo que permitió varios avances, incluyendo espectroscopia de óvulos y diagnósticos in vitro. Los límites de sensibilidad y detección existentes aún no son óptimos para el análisis metabólico de células de mamíferos individuales o para su inclusión en ensayos de microfluidos en línea. Como estrategia alternativa de detección de RMN, Han surgido sensores cuánticos basados en centros de vacantes de nitrógeno (NV) en diamantes debido a su resolución espacial submicrométrica y detección no inductiva.
Amplitud de proyección del campo magnético de CA nuclear (integrada en el volumen del sensor) en función del volumen de agua. El volumen de detección efectivo (40 pL) se define como el volumen en el que la amplitud de proyección del campo de CA nuclear es igual a la mitad del volumen efectivo total de la muestra. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895
Los científicos implementaron previamente el método para detectar fluctuaciones tempranas de nanoescala de magnetización nuclear para mejorar la polarización. Utilizaron disolventes viscosos para mejorar la resolución de frecuencia a ~ 100 Hz para obtener la resolución de grandes cambios químicos en B 0 =3 T (Tesla). Aunque se pueden realizar más mejoras en la resolución aumentando el volumen de detección (V), tenían un costo para SNR. En el presente trabajo, Smits y col. reportar una mejora de orden de magnitud en la resolución espectral para obtener una sensibilidad de concentración de ~ 27 M s 1/2 . Lograr esto, separaron espacialmente las fases de polarización y detección del experimento en una configuración de microfluidos.
El equipo de investigación utilizó fuertes imanes permanentes (1,5 Tesla) para generar polarización de espín nuclear y realizó la detección a 13 mT utilizando bobinas de Helmholtz para simplificar la tarea de estabilizar los anchos de línea de RMN a niveles sub-hertz. Facilitaron el uso de sensores cuánticos de diamantes como detectores de RMN de microfluidos en línea a bajas frecuencias de microondas. Las mejoras permitieron a Smits et al. para realizar espectroscopía de correlación bidimensional (2-D) (COSY) de analitos líquidos dentro de un volumen de detección efectivo de ~ 40 pL (pico-litros). Los investigadores tienen la intención de combinar esta plataforma con los avances en la polarización nuclear dinámica utilizando agentes de polarización externos y potencialmente hiperpolarización óptica con centros de NV para permitir la espectroscopia de RMN de los metabolitos en concentraciones fisiológicas en una resolución espacial unicelular.
En la configuración experimental, Smits y col. almacenó los analitos fluidos en un recipiente presurizado con helio con tasas de flujo variables de hasta 50 µl / s. El tiempo de permanencia de los analitos se aproximó a 6 s, más largo que el tiempo de relajación del espín de los analitos estudiados (por ejemplo T 1 para agua ≈ 3s) que conduce a una polarización de equilibrio de ~ 5x10 -6 . A continuación, el analito fluyó a una región de detección para su identificación mediante NV NMR. Para realizar la detección de NV NMR, Los científicos utilizaron un microscopio de epifluorescencia hecho a medida y membranas de diamante orientadas fabricadas en el estudio. en cuatro posibles ejes NV para alinearse con el campo magnético en la configuración.
Caracterización de NV NMR prepolarizada. (A) La secuencia de pulsos de lectura sincronizada. Consiste en un tren de pulsos XY8-N que realizan sucesivas mediciones de fase del campo magnético de CA producido por los núcleos de procesamiento. La fluorescencia medida refleja una versión con alias de la proyección del campo de corriente alterna nuclear. La secuencia completa se repite cada 2,5 a 4,25 s (1,25 s para flujo y el resto para detección). (B) Espectros NV NMR (valor absoluto de la transformada de Fourier) de agua (rojo) y un campo de prueba de amplitud de 2.5 nT aplicado (azul) para un tiempo de adquisición efectivo de 5.2 s (promedio de 60 trazas; tiempo total de medición, 150 s). La amplitud de la señal de RMN obtenida de la señal del fotodetector procesada se registra en μV. La conversión a la amplitud del campo magnético (en nT) se deriva del campo de prueba calibrado. Recuadro:La DE del piso de ruido revela aBmin =45 pT. A partir de estos datos, inferimos una concentración mínima detectable de 27 M s1 / 2 (SNR =3). Incorporando todo el tiempo muerto experimental, la sensibilidad a la concentración es ∼45 M s1 / 2. (C) Un espectro NV NMR de agua de alta resolución (parte imaginaria de la transformada de Fourier) revela un ancho completo a la mitad del ancho de línea máximo (FWHM) de 0,65 ± 0,05 Hz. Los datos se obtuvieron promediando 60 trazas, cada 3 s de duración. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895
Smits y col. fabricó el chip de microfluidos para albergar el sensor de diamante, el dispositivo contenía un chip de cobre en un portaobjetos de vidrio para entregar las microondas. Los científicos también incluyeron un bucle de excitación de radiofrecuencia (RF) entre el diamante y la bobina de retroalimentación de RMN, y un canal de microfluidos que encierra el sensor de diamante y el analito en contacto. Diseñaron puertos de microfluidos para combinar tubos de analitos externos dentro del chip y utilizaron un rayo láser de 20 µm de diámetro para excitar los centros NV a través de una membrana de diamante de 35 µm de espesor.
Posteriormente, el equipo de investigación aplicó una serie de secuencias de pulsos de microondas XY8-5 al centro NV para detectar el campo de corriente alterna nuclear. Utilizaron agua desionizada para determinar la sensibilidad y los límites de resolución espectral del aparato. Para optimizar la resolución espectral, ajustaron las bobinas de compensación de gradiente y demostraron las capacidades del espectrómetro de RMN NV mediante la obtención de espectros de RMN de protones de diversos analitos de fluidos.
Por ejemplo, los científicos obtuvieron espectros de RMN NV característicos para el fosfato de trimetilo (TMP) y 1, Compuestos de 4-difluorobenceno (DFB) en el estudio. Después de establecer el potencial para detectar espectros de RMN con resolución sub-hertz y altas relaciones señal-ruido (SNR) para los dos compuestos, utilizaron la plataforma para realizar espectroscopía de RMN COSY 2-D. Para esto, Smits y col. realizó dos variantes del análisis COZY 2-D para sondear interacciones nucleares dentro de DFB (1, 4-difluorobenceno) y realizó todas las simulaciones utilizando el paquete de software SPINACH para 2-D NMR.
RMN 1D. Señales NV NMR en el dominio del tiempo (izquierda) y en el dominio de la frecuencia (derecha) para (A) agua, (B) fosfato de trimetilo (TMP), y (C) 1, 4-difluorobenceno (DFB). Las señales se promediaron sobre ∼103 trazas para una adquisición total de ∼1 hora. Se aplica un filtro de paso de banda de ancho de banda de ∼1 kHz a los datos en el dominio del tiempo para una mejor visualización. Los espectros en el dominio de la frecuencia muestran el componente imaginario de la transformada de Fourier. Cada espectro se ajusta a las funciones gaussianas (líneas negras). Para TMP, restringimos los anchos de ambas líneas para que sean iguales con una relación de amplitud de 1:1 y encontramos JHP =11.04 ± 0.06 Hz. Para DFB, restringimos los anchos de las tres líneas para que sean iguales con una relación de amplitud de 1:2:1 y encontramos JHF¯ =6.09 ± 0.05 Hz. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895.
La resolución sub-hertz demostrada y las técnicas de RMN multidimensionales pueden allanar el camino para el uso de sensores cuánticos de diamantes dentro del análisis con guiones en línea. metabolómica unicelular y farmacodinámica de masa limitada. Smits y col. tienen como objetivo la alta resolución espacial resultante y el formato de epifluorescencia para facilitar el análisis químico de alto rendimiento y la obtención de imágenes de RMN de cultivos celulares con resolución de una sola célula. Las limitaciones del presente dispositivo incluyen los tiempos promediados sustanciales requeridos a concentraciones fisiológicas que van desde el volumen micromolar al milimolar. Los investigadores proponen utilizar campos magnéticos más altos con secuencias de pulsos de microondas XY8-N más largas y sensibles para mejorar la sensibilidad de la RMN y la eficiencia de recolección de fotones en contraste con los métodos existentes. A largo plazo, esperan que las mayores ganancias en sensibilidad se produzcan a través de métodos de hiperpolarización óptica no invasivos.
RMN ACOGEDORA 2D de DFB. (A) Secuencia de pulsos COSY homonuclear, (B) espectro simulado, y (C) espectro NV NMR experimental de DFB. (D) Una secuencia COZY heteronuclear modificada revela picos fuera de la diagonal tanto en la simulación (E) como en el experimento (F). Las escalas de color corresponden al valor absoluto normalizado de la transformada de Fourier 2D. Los ejes verticales (f1 - fref) corresponden a las frecuencias de la dimensión t1, y los ejes horizontales (f2 - fref) corresponden a las frecuencias de la dimensión t2. C ª), Se utilizaron 14 valores de t1 en incrementos de 0,021 s hasta 0,294 s. El tiempo total de adquisición fue de 22 horas. En (F), Se utilizaron 16 valores de t1 en incrementos de 0.021 s hasta 0.336 s. El tiempo total de adquisición fue de 25 horas. En ambos casos, la adquisición de t2 abarcó de 0 a 1,25 s. Todas las simulaciones se realizaron utilizando el paquete SPINACH. Los datos experimentales y de simulación utilizan las mismas funciones de ventana. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895.
El uso de una intensidad de campo externa baja (B 0 ) de 13 mT fue otra limitación en el estudio, ya que restringió la capacidad de resolver la división espectral debido a cambios químicos. El equipo tiene como objetivo mejorar la resolución del cambio químico aumentando B 0 hasta ~ 0,25 T, utilizando el esquema de detección actual. Además, aunque el sensor de microfluidos de RMN tenía un volumen de detección efectivo de ~ 40 pL, los científicos necesitaron varios mililitros de analito para llenar el flujo total del aparato. Por lo tanto, los chips microfluídicos futuros pueden miniaturizar u omitir los pasos de prepolarización o utilizar canales microfluídicos más pequeños para la detección en un sistema fluídico más grande.
De este modo, Janis Smits y sus colaboradores demostraron el uso de sensores cuánticos de diamante para aplicaciones de RMN de microfluidos. Demostraron que separar los pasos de polarización y detección permitió una mejora de orden de magnitud en la resolución espectral en comparación con los estudios de RMN de diamantes existentes. Los científicos validaron la plataforma realizando RMN 2-D en analitos de fluidos y proponen sus aplicaciones futuras en campos de investigación multidisciplinarios.
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