Los investigadores han desarrollado un enfoque de espectroscopia Raman no invasivo y sin etiquetas que puede adquirir imágenes microscópicas de muestras biológicas e identificar una amplia gama de biomoléculas con una velocidad y sensibilidad sin precedentes.

"Nuestro trabajo podría conducir a un dispositivo no invasivo, sin etiquetas y fácil de usar para uso clínico", dijo el líder del equipo de investigación, Dario Polli, del Politecnico di Milano en Italia. "Este microscopio innovador, junto con algoritmos basados ​​en el aprendizaje profundo, eventualmente podría facilitar y agilizar el diagnóstico del cáncer al permitir la visualización de los constituyentes químicos de las células y los tejidos humanos".

En la revista Optics Express , los investigadores describen su nueva técnica, que se basa en la microscopía coherente de dispersión Raman anti-stokes (CARS). La microscopía CARS produce imágenes basadas en las firmas vibratorias de las moléculas al explotar la interacción entre los pulsos láser ultracortos y las muestras biológicas.

El nuevo enfoque proporciona acceso a la región difícil de detectar del espectro vibratorio conocida como la región de la huella dactilar, que se extiende de 400 a 1800 cm ⁻¹ . Aunque muchos compuestos individuales pueden identificarse utilizando sus huellas dactilares vibratorias en esta región, tiende a producir señales débiles que son difíciles de detectar.

"Las técnicas comúnmente utilizadas en las ciencias biomédicas a menudo requieren tinción, lo que no solo es engorroso, sino que también puede introducir alteraciones estructurales y químicas que pueden conducir a artefactos o errores en las imágenes y el procesamiento de datos", dijo Polli. "Debido a que nuestro sistema puede distinguir entre muchas especies químicas diferentes en tejidos biológicos sin etiquetas, podría ser útil para obtener imágenes de células vivas y analizar biopsias de tejido".

Menor tasa de repetición, imágenes más rápidas

Este nuevo trabajo forma parte del proyecto CRIMSON, cuyo objetivo es desarrollar un dispositivo de imagen llave en mano que utilice espectroscopia vibratoria para la clasificación rápida de células y tejidos. El objetivo del proyecto es transformar el estudio del origen celular de las enfermedades para permitir nuevos enfoques que podrían avanzar en la terapia personalizada.

Como paso clave hacia este objetivo, los investigadores desarrollaron un microscopio CARS basado en un láser comercial que produce pulsos ultracortos con una duración de aproximadamente 270 femtosegundos en el rango de longitud de onda del infrarrojo cercano. Diseñaron el sistema de microscopía para usar pulsos láser con una tasa de repetición de 2 MHz, que es mucho menor que los 40 u 80 MHz que usan la mayoría de los otros sistemas CARS.

Esta tasa de repetición más baja reduce el daño fototérmico a la muestra porque crea un retraso de 0,5 microsegundos entre dos pulsos consecutivos. También produce una energía de pulso más alta y una intensidad máxima en el punto focal, lo que genera una señal CARS más fuerte y permite una velocidad de adquisición más rápida.

"La ventaja más importante de la tasa de repetición más baja es que nos permitió generar pulsos de Stokes de banda ancha y desplazados hacia el rojo que cubren toda la región vibratoria de la huella dactilar mediante el uso de generación de supercontinuo de luz blanca en un cristal a granel", dijo Federico Vernuccio, estudiante de doctorado. en el Politecnico di Milano y primer autor del estudio. "En comparación con otros métodos, este enfoque es técnicamente más simple, compacto y robusto".

El uso de una región espectral que se desplaza hacia el rojo en comparación con las configuraciones estándar significa que se pueden usar intensidades de láser más altas antes de la aparición del fotodaño. Los investigadores también desarrollaron nuevos algoritmos que combinan enfoques computacionales numéricos estándar con inteligencia artificial. Estos algoritmos recuperan más información de los datos adquiridos y la convierten en imágenes que permiten distinguir fácilmente diferentes especies químicas.

"Gracias a nuestras mejoras, el sistema CARS ofrece imágenes de alta calidad a una velocidad de adquisición de última generación", dijo Vernuccio. "Nuestro sistema tiene un tiempo de permanencia de píxeles de menos de 1 milisegundo sin comprometer la integridad de la muestra. Esta velocidad está limitada por la frecuencia de actualización del espectrómetro".

Sensibilidad a alta velocidad

Para probar su sistema, los investigadores utilizaron muestras de referencia para comparar los espectros obtenidos con el nuevo microscopio con los adquiridos utilizando una técnica de espectroscopia vibratoria de última generación, aunque más lenta. Los dos métodos mostraron una excelente concordancia, lo que demuestra que el nuevo sistema puede generar espectros a muy altas velocidades con buena resolución espectral y especificidad química.

Luego, los investigadores determinaron el límite de detección de su sistema mediante la adquisición de espectros CARS de un conjunto de soluciones de dimetilsulfóxido con varias concentraciones. El sistema pudo medir la concentración química con una sensibilidad sin precedentes de 14,1 mmol/litro, aproximadamente el doble de la sensibilidad de otros sistemas CARS que funcionan en la región de huellas dactilares.

También demostraron la capacidad del sistema para distinguir y localizar espacialmente varias microesferas de plástico transparentes en función de su firma vibratoria y tomaron medidas de tejidos biológicos para demostrar que la técnica funciona en muestras biológicas sin inducir daño.

"Nuestro microscopio CARS permite imágenes sin etiquetas con especificidad química a velocidades más altas, lo que hace que las imágenes Raman de células vivas sean más factibles", dijo Polli. "Esto podría permitir que nuestro sistema se use para analizar las interacciones de las células cancerosas con las células inmunitarias o para caracterizar cómo la quimioterapia afecta a las células, por ejemplo".

Los investigadores ahora están trabajando para mejorar su sistema mediante la creación de un rango de longitud de onda aún más amplio de pulsos de Stokes a través de la generación de supercontinuo de luz blanca. Esto mejoraría tanto la velocidad de obtención de imágenes como el número de analitos químicos detectables. También están trabajando hacia la comercialización mediante el desarrollo de software fácil de usar, fuentes ópticas compactas y diseños para un prototipo comercial y un sistema de detección. + Explora más

Espectroscopia vibratoria de huellas dactilares de THz a una velocidad espectral ultrarrápida