Los investigadores han desarrollado una nueva técnica de microscopía que puede adquirir imágenes de superresolución 3-D de estructuras subcelulares de aproximadamente 100 micrones de profundidad dentro del tejido biológico. incluido el cerebro. Al dar a los científicos una visión más profunda del cerebro, el método podría ayudar a revelar cambios sutiles que ocurren en las neuronas a lo largo del tiempo, durante el aprendizaje, o como resultado de una enfermedad.

El nuevo enfoque es una extensión de la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED), una técnica revolucionaria que logra una resolución a nanoescala superando el límite de difracción tradicional de los microscopios ópticos. Stefan Hell ganó el Premio Nobel de Química en 2014 por desarrollar esta técnica de imágenes de superresolución.

En Optica , los investigadores describen cómo utilizaron su nuevo microscopio STED para obtener imágenes, en superresolución, la estructura tridimensional de las espinas dendríticas en el interior del cerebro de un ratón vivo. Las espinas dendríticas son pequeñas protuberancias en las ramas dendríticas de las neuronas, que reciben entradas sinápticas de las neuronas vecinas. Desempeñan un papel crucial en la actividad neuronal.

"Nuestro microscopio es el primer instrumento del mundo en lograr una superresolución 3-D STED en el interior de un animal vivo, ", dijo el líder del equipo de investigación Joerg Bewersdorf de la Facultad de Medicina de Yale." Estos avances en la tecnología de imágenes de tejido profundo permitirán a los investigadores visualizar directamente las estructuras subcelulares y la dinámica en su entorno de tejido nativo, ", dijo Bewersdorf." La capacidad de estudiar el comportamiento celular de esta manera es fundamental para obtener una comprensión completa de los fenómenos biológicos para la investigación biomédica, así como para el desarrollo farmacéutico ".

Profundizando

La microscopía STED convencional se utiliza con mayor frecuencia para obtener imágenes de muestras de células cultivadas. Usar la técnica para obtener imágenes de tejidos gruesos o animales vivos es mucho más desafiante, especialmente cuando los beneficios de superresolución de STED se extienden a la tercera dimensión para 3-D-STED. Esta limitación se produce porque el tejido grueso y ópticamente denso evita que la luz penetre profundamente y se enfoque correctamente. perjudicando así las capacidades de superresolución del microscopio STED.

Para superar este desafío, los investigadores combinaron microscopía STED con excitación de dos fotones (2PE) y óptica adaptativa. "2PE permite obtener imágenes más profundas en el tejido mediante el uso de longitudes de onda del infrarrojo cercano en lugar de la luz visible, "dijo Mary Grace M. Velasco, primer autor del artículo. "La luz infrarroja es menos susceptible a la dispersión y, por lo tanto, es más capaz de penetrar profundamente en el tejido ".

Los investigadores también agregaron óptica adaptativa a su sistema. "El uso de óptica adaptativa corrige las distorsiones de la forma de la luz, es decir., las aberraciones ópticas, que surgen cuando se toman imágenes en y a través del tejido, "dijo Velasco." Durante la toma de imágenes, el elemento adaptativo modifica el frente de onda de luz de la forma exactamente opuesta a como lo hace el tejido en la muestra. Las aberraciones del elemento adaptativo, por lo tanto, cancelar las aberraciones del tejido, creando condiciones de imagen ideales que permitan recuperar las capacidades de superresolución STED en las tres dimensiones ".

Ver cambios en el cerebro

Los investigadores probaron su técnica 3-D-2PE-STED mediante la obtención de imágenes de estructuras bien caracterizadas en células cultivadas en un cubreobjetos. En comparación con el uso de 2PE solo, 3-D-2PE-STED resolvió volúmenes 10 veces más pequeños. También demostraron que su microscopio podría resolver la distribución de ADN en el núcleo de las células de la piel de ratón mucho mejor que un microscopio convencional de dos fotones.

Después de estas pruebas, los investigadores utilizaron su microscopio 3-D-2PE-STED para obtener imágenes del cerebro de un ratón vivo. Hicieron zoom en parte de una dendrita y resolvieron la estructura tridimensional de las espinas individuales. Luego tomaron imágenes de la misma área dos días después y mostraron que la estructura de la columna había cambiado durante este tiempo. Los investigadores no observaron ningún cambio en la estructura de las neuronas en sus imágenes o en el comportamiento de los ratones que pudiera indicar daño de las imágenes. Sin embargo, planean estudiar esto más a fondo.

"Las espinas dendríticas son tan pequeñas que sin superresolución es difícil visualizar su forma tridimensional exacta, y mucho menos cualquier cambio en esta forma a lo largo del tiempo, ", dijo Velasco." 3-D-2PE-STED ahora proporciona los medios para observar estos cambios y para hacerlo no solo en las capas superficiales del cerebro, pero también más profundo por dentro, donde ocurren más conexiones interesantes ".