Las imágenes de microscopía de barrido láser de dos fotones se aplican comúnmente para estudiar la actividad neuronal en resoluciones celulares y subcelulares en cerebros de mamíferos. Estos estudios aún se limitan a una sola región funcional del cerebro. En un informe reciente, Mengke Yang y sus colegas del Centro de Innovación de Instrumentos de Investigación Cerebral, Instituto de Neurociencia, Centro de Neurociencia de Sistemas y Tecnología de Fabricación Avanzada de Sistemas Ópticos en China, Alemania y el Reino Unido desarrollaron una nueva técnica denominada explorador in vitro en tiempo real de dos fotones de múltiples áreas (MATRIEX). El método permitió al usuario apuntar a múltiples regiones del cerebro funcional con un campo de visión (FOV) de aproximadamente 200 µm de diámetro para realizar Ca de dos fotones ²⁺ imágenes con resolución de celda única simultáneamente en todas las regiones.

Yang y col. llevó a cabo imágenes funcionales en tiempo real de las actividades de una sola neurona en la corteza visual primaria, corteza motora primaria y región CA1 del hipocampo durante estados anestesiados y despiertos en ratones. La técnica MATRIEX puede configurar de forma única múltiples campos de visión microscópicos utilizando un solo dispositivo de escaneo láser. Como resultado, la técnica se puede implementar como un módulo óptico adicional dentro de la exploración de un solo haz convencional existente, microscopios de dos fotones sin modificaciones adicionales. El MATRIEX se puede aplicar para explorar la actividad neuronal de múltiples áreas in vivo para la función del circuito neural de todo el cerebro con resolución de una sola célula.

La microscopía láser de dos fotones se originó en la década de 1990 para hacerse popular entre los neurocientíficos interesados ​​en estudiar las estructuras y funciones neuronales in vivo. Una de las principales ventajas de las imágenes de dos y tres fotones para los cerebros vivos incluye la resolución óptica lograda en tejidos cerebrales densamente marcados que dispersan fuertemente la luz. durante el cual los píxeles de la imagen seccionados ópticamente se pueden escanear y adquirir con una diafonía mínima. Sin embargo, las ventajas también causaron importantes inconvenientes al método al evitar la vista simultánea de dos objetos dentro de una distancia específica. Los investigadores habían implementado previamente muchas estrategias para ampliar los límites, pero los métodos fueron difíciles de implementar en los laboratorios de investigación en neurociencia. Sin embargo, Existe una demanda cada vez mayor en neurociencia para investigar las funciones neuronales de todo el cerebro con resolución unicelular in vivo.

En un enfoque sencillo, Los científicos pueden colocar dos microscopios sobre el mismo cerebro animal para obtener imágenes de la corteza y el cerebelo simultáneamente. Pero tales esfuerzos pueden conducir a aumentos sustanciales en complejidad y costo. Por lo tanto, las altas expectativas existentes de rendimiento y viabilidad plantean una cuestión de ingeniería muy desafiante sobre cómo un solo sistema de imágenes puede obtener simultáneamente imágenes microscópicas en vivo de múltiples regiones del cerebro in vivo. Para abordar la pregunta, Yang y col. introdujo un nuevo método que combinaba el aumento de dos etapas y el acoplamiento óptico de varios ejes.

Se dieron cuenta del método utilizando un objetivo seco (DO) de bajo aumento, con múltiples inmersos en agua, objetivos miniaturizados (MO) bajo el objetivo seco. Los científicos colocaron cada uno de los OM en la posición objetivo deseada y la profundidad en el tejido cerebral. El equipo utilizó el nuevo conjunto de objetos compuestos de manera similar al objetivo original del microscopio sumergido en agua sin modificaciones adicionales al subsistema de exploración y adquisición de imágenes.

El equipo de investigación primero reunió el objetivo del compuesto MATRIEX. Para esto, Reemplazaron el objetivo del microscopio de inmersión en agua convencional con un conjunto de objetivo compuesto personalizado, dentro de un microscopio de barrido láser de dos fotones equipado con un dispositivo de barrido de trama de haz único convencional. El conjunto compuesto contenía múltiples MO (objetivos miniaturizados) insertados a través de múltiples craneotomías durante las cuales los científicos pegaron una cámara de plástico impresa en 3D al cráneo del modelo de ratón. La cámara alineó aproximadamente los MO con el mismo espacio para ajustar la posición lateral y la profundidad. Yang y col. manipuló con precisión los OM individuales para ver los objetos bajo todos los OM simultáneamente en el mismo plano de imagen.

Implementaron el método MATRIEX utilizando dos principios; Ampliación de dos etapas y acoplamiento multieje. Por ejemplo, utilizando un aumento de dos etapas con el objetivo seco (DO) solo, observaron perlas de 20 µm como pequeños puntos borrosos mientras observaban nítidos, círculos redondos a través del conjunto compuesto. Durante el acoplamiento multieje, los científicos acoplaron un solo DO con varios OM en el mismo plano de imagen. Usando un escaneo de trama simple en un solo marco rectangular, el equipo de investigación adquirió una imagen rectangular que contenía múltiples campos de visión (campo de visión) circulares, donde cada campo de visión correspondía a un modus operandi con una mínima diafonía de píxeles entre campos de visión.

Los científicos atribuyeron el aumento de la apertura numérica (NA) por permitir una mejor resolución con el conjunto compuesto. Las lentes asociadas también eran flexibles y se diseñaron a medida para la producción en masa a bajo costo para ayudar al diseño experimental. La característica principal de MATRIEX fue su capacidad para obtener imágenes de múltiples objetos simultáneamente a grandes intervalos de profundidad. Para resaltar esto, Yang y col. diseñó diferentes MO con diversos parámetros, colocándolos a una profundidad específica donde los planos del objeto correspondientes se conjugan en un mismo eje. En la práctica, El equipo de investigación compensó los pequeños desajustes entre la profundidad del objeto deseada y la real ajustando los MO individualmente a lo largo de cada uno de los ejes z.

Típicamente, bajo el OD (objetivo seco), el tamaño lateral máximo de la zona objetivo está limitado por el tamaño máximo del campo de exploración. Por ejemplo, utilizando un OD con un aumento de 2x y una zona objetivo de 12 mm de diámetro, los científicos pueden obtener imágenes de todo el cerebro de un ratón adulto. En este estudio, Yang y col. simultáneamente, obtuvieron imágenes de la corteza de asociación frontal y el cerebelo del ratón. En la práctica, Se adaptó un objetivo de aire 4x para lograr una mejor resolución para observar estructuras dendríticas finas.

Como prueba de principio, el equipo de investigación utilizó MATRIEX para realizar Ca de dos fotones simultáneos ²⁺ Imágenes de neuronas marcadas con fluorescencia en la corteza visual primaria (región V1), corteza motora primaria (región M1) y región CA1 del hipocampo de ratones. En la configuración de los tres MO, los científicos colocaron dos MO adecuados para la región V1 y M1, directamente encima de la corteza e insertó un MO dentro de la región CA1 del hipocampo después de extirpar quirúrgicamente un tejido cortical. Luego, el equipo diseñó las lentes para los planos de objeto correspondientes a V1, M1 y CA1 para la conjugación en el mismo plano de imagen. Usando un microscopio de dos fotones equipado con un escáner resonante de 12 kHz, los científicos escanearon la imagen completa para observar tres campos de visión y sus células individuales después de ampliar las tres secciones diferentes para resolver neuronas individuales. Luego notaron que la potencia del láser se distribuiría entre varios campos de visión.

Mientras que Yang et al. podría haber obtenido estos resultados utilizando imágenes convencionales de un solo campo de visión dentro de una sola región del cerebro, la técnica MATRIEX les proporcionó datos más allá de los que se ofrecen con las técnicas de imagen de un solo campo de visión. Tomados en conjunto, Estos resultados permitieron una distribución y transformación altamente no homogénea de los patrones de actividad espontánea del estado anestesiado al estado despierto en ratones, que abarca un nivel de circuito de todo el cerebro con resolución de una sola célula.

De este modo, Menge Yang y sus colaboradores desarrollaron la técnica MATRIEX basada en el principio de aumento en dos etapas y acoplamiento óptico multieje. Simultáneamente llevaron a cabo dos fotones Ca ²⁺ Imágenes en las actividades de la población neuronal a diferentes profundidades en diversas regiones (V1, M1 y CA1) en ratones anestesiados y despiertos con resolución unicelular. En tono rimbombante, cualquier microscopio convencional de dos fotones se puede transformar en un microscopio MATRIEX, conservando todas las funcionalidades originales. La clave de la transformación se basa en el diseño de un conjunto objetivo compuesto. Los investigadores pueden utilizar diferentes MO cuidadosamente diseñados para adaptarse a diversas regiones del cerebro con una compatibilidad del 100 por ciento entre la técnica MATRIEX y la microscopía convencional. El equipo de investigación espera que la técnica MATRIEX avance sustancialmente en tres dimensiones, dinámica del circuito neural de todo el cerebro a resolución de una sola célula.

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