Representación esquemática del sistema de microscopía híbrida que contiene un subsistema para microscopía optoacústica de longitud de onda dual a 488 nm y 808 nm, co-alineado con un subsistema para microscopía multifotónica a 1043 nm. a) Amplificador AMP, Cámara CCD de campo claro, Tarjeta de adquisición de datos DAQ, Espejo dicroico DM, Controlador de espejo galvanométrico GC, Demodulador IQD IQ, Oscilador local LO1 1, Oscilador local LO2 2, Filtros de densidad neutra NDF, OA optoacústico, DE filtro óptico, Computadora personal de la PC, Agujero de alfiler de PH, Tubo fotomultiplicador PMT, Generación de segundo armónico SHG, THG de tercera generación armónica, Fluorescencia de excitación de dos fotones TPEF, Etapas motorizadas xyz. b) El espectro de las longitudes de onda de excitación y detección en imágenes híbridas FDOM / multifotón (MP). c) Comparación esquemática entre microscopía optoacústica en el dominio del tiempo (TD), que utiliza breves pulsos de luz, y microscopía optoacústica de dominio de frecuencia (FD), que se basa en la intensidad del láser modulada a múltiples frecuencias discretas. Crédito: Luz:ciencia y aplicaciones . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Las imágenes optoacústicas impulsadas por ráfagas cortas de láseres de onda continua (CW) pueden estimular la emisión de ondas de ultrasonido dentro de un animal o en sujetos humanos. El método puede capturar de forma no invasiva el flujo sanguíneo y producir imágenes tridimensionales de microarquitectura celular. Escribiendo en Luz:ciencia y aplicaciones , Stephan Kellnberger y sus colegas del Instituto de Imágenes Médicas y Biológicas, ahora informan sobre la posibilidad de obtener imágenes optoacústicas de alta fidelidad con láseres rentables controlados en múltiples frecuencias.
Los autores demostraron experimentalmente la frecuencia múltiple, generación de imágenes de alta fidelidad de arquitectura biológica mediante la obtención de imágenes de microvasculatura de tejido de peces y ratones. En los experimentos de imágenes, superpusieron detalles estructurales que solo aparecían en frecuencias específicas de interés. Los autores también identificaron de forma no invasiva la velocidad del flujo sanguíneo en la microvasculatura tisular mediante el seguimiento de los cambios de frecuencia utilizando el efecto Doppler optoacústico.
La detección optoacústica (fotoacústica) generalmente requiere tecnologías láser complejas. Tales técnicas pueden generar una longitud de nanosegundos (1-100 ns), pulsos de fotones cortos de alta energía que iluminan convencionalmente energía transitoria (de corta duración) en el dominio del tiempo (TD). Los pulsos ultracortos pueden estimular la emisión de ondas ultrasónicas de banda ancha, recogidos en el rango de microsegundos para formar imágenes optoacústicas. Sin embargo, La tecnología láser compleja puede imponer una frecuencia de repetición de pulso (PRF) baja y limitar el número de longitudes de onda disponibles simultáneamente para la obtención de imágenes espectrales. Para evitar tales límites, Kellnberger y col. desarrolló microscopía optoacústica de dominio de frecuencia (FDOM), en el que la intensidad de la luz se puede controlar o modular en múltiples frecuencias discretas utilizando hardware rentable.
Explicación de la codificación de frecuencia en FDOM de longitud de onda dual. a) Esquema simplificado de codificación de frecuencia en diferentes longitudes de onda. La fuente láser 1 que emite a λ1 =488 nm se cargó con la frecuencia de modulación más baja f1, mientras que la fuente láser 2 que emite a λ2 =808 nm se cargó con la frecuencia de modulación más alta. Durante la toma de imágenes, aumentamos la modulación de la longitud de onda λ1 y disminuimos la frecuencia de modulación de λ2 en pasos de fstep usando números impares de frecuencias de modulación. b) Representación esquemática de múltiples frecuencias de modulación utilizadas para la formación de imágenes, mostrando la superposición de frecuencias a dos longitudes de onda. Crédito: Luz:ciencia y aplicaciones . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Hasta ahora, Las imágenes optoacústicas solo se han basado en técnicas que detectan señales en el dominio del tiempo (TD) o aquellas que solo escanean una sola frecuencia en una o dos longitudes de onda en el dominio de la frecuencia (FD). El presente estudio fue el primero en realizar imágenes optoacústicas in vivo en un modelo animal mediante iluminación simultánea con dos longitudes de onda.
Los científicos combinaron FDOM en un sistema híbrido para examinar la relación entre la formación de imágenes y el control de frecuencia. El uso de frecuencias discretas (un máximo de nueve), permitió primero mediciones de desplazamiento Doppler optoacústico no invasivas como observaciones de flujo en una cámara de flujo de microfluidos en el laboratorio, y en la microvasculatura tisular in vivo a partir de entonces. En el estudio, Kellnberger y col. utilizó dos láseres de diodo CW que emiten luz a 488 nm y 808 nm para la iluminación.
Los científicos implementaron el FDOM, operando en el rango de frecuencia de 5-50 MHz, como un sistema híbrido con microscopía multifotónica (MP) que opera a 1043 nm. Luego realizaron imágenes bidimensionales / tridimensionales basadas en mediciones de fase y amplitud de ultrasonido en múltiples frecuencias. La amplitud y fase de las señales optoacústicas generadas se resolvieron mediante demodulación en tiempo real y se registraron mediante un convertidor de analógico a digital. Debido a las altas tasas de repetición, el FDOM logró una alta relación señal-ruido (SNR), que conduce a las imágenes de alta fidelidad observadas. En total, el estudio examinó la relación entre la frecuencia de modulación, fidelidad de imagen y la relación señal / ruido (SNR).
Imágenes FDOM de longitud de onda única de una sutura y muestras de pez cebra ex vivo. a) Una ilustración esquemática del escaneo de dos suturas cruzadas. b) Imágenes FDOM codificadas por colores de dos suturas de 50 µm, basado en iluminación a 488 nm y frecuencias de modulación de 10, 20, 30, y 40 MHz. La representación del espacio de frecuencia de color (FSR) superpone las contribuciones de cada frecuencia de modulación. La imagen FSR en escala de grises basada en cuatro frecuencias muestra la imagen final. c) Perfil de la sección transversal de la línea discontinua mostrada en el panel b, que compara los contrastes revelados por las distintas frecuencias de modulación. d) Imágenes ex vivo de un globo ocular de larva de pez cebra. La imagen violeta se reconstruyó utilizando frecuencias bajas (L) (10, 15, y 20 MHz); la imagen verde usando frecuencias medias (M) (25, 30, y 35 MHz); y la imagen roja con frecuencias altas (H) (40, 45, y 50 MHz). La superposición codificada por colores de todas las frecuencias (FSR, 10 a 50 MHz) destaca la contribución de cada región espectral. e) El color naranja representa la suma de amplitud de las nueve frecuencias de modulación empleadas. f) Una imagen de campo brillante de un ojo de pez cebra, validando la fidelidad de las imágenes FDOM. g) Una comparación de las relaciones señal / ruido (SNR) de imágenes de dos suturas cruzadas (40 µm de diámetro) obtenidas mediante microscopía optoacústica FD y TD. La imagen FDOM arrojó una SNR de ~ 35 dB. h) En entornos experimentales similares, La microscopía TD dio como resultado una SNR de ~ 29 dB. Crédito: Luz:ciencia y aplicaciones . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Para identificar las características de la imagen fotoacústica FD, los científicos obtuvieron imágenes de un par de suturas cruzadas en agua a dos longitudes de onda (488 nm y 808 nm) y frecuencias de modulación discretas. La superposición de varias contribuciones de frecuencia transportaba información del objeto de la imagen (suturas).
Para extraer información de estructuras más complejas, Kellnberger y col. fotografió el ojo de lava de pez cebra de tipo salvaje de 5 días ex vivo, utilizando nueve frecuencias de modulación que abarcan 10-50 MHz en pasos de 5 MHz. Los científicos también compararon la SNR (relación señal / ruido) entre el método FDOM y la TD convencional. que variaba según los parámetros experimentales (energía láser, potencia empleada y hardware de adquisición de datos).
Por tanto, los datos de fase y amplitud de multifrecuencia podrían procesarse para la reconstrucción de imágenes en 3-D utilizando una transformada de Fourier basada en la representación de frecuencia-espacio (FSR) y la representación de tiempo-espacio (TSR). Comparado con TSR, La reconstrucción de imágenes basada en FSR fue computacionalmente más rápida y no requirió inversión de datos durante la reconstrucción de imágenes.
Imágenes FDOM de longitud de onda única y doble de una oreja de ratón in vivo. a) Imágenes FDOM a 488 nm. El color cian representa la imagen reconstruida, de nueve frecuencias igualmente espaciadas en el rango de 10 a 50 MHz. b – d) Imágenes individuales obtenidas a frecuencias de modulación de 10, 30, y 50 MHz, que representan las estructuras en el cuadro punteado en el panel a. e) SNR en función de n frecuencias que se utilizaron para la reconstrucción de FSR. Se observa una mejoría asintótica para n> 8 frecuencias discretas. f) Una vista de perfil del cuadro punteado en el panel a, que está delineado por una flecha punteada blanca. Demuestra la relación entre la frecuencia de modulación y la resolución de la imagen. Las cruces amarillas resaltan la resolución de la imagen en función de la frecuencia de modulación:una modulación más rápida (50 MHz) puede resolver claramente estructuras pequeñas, incluso hasta 4 µm, mientras que la modulación más lenta (10 MHz) no puede. g – l) Imágenes híbridas FDOM / multifotón de una oreja de ratón después de la inyección de células de melanoma. g) Una imagen de superposición que se obtuvo utilizando cuatro modalidades de microscopía sin etiqueta:FDOM a 488 nm y 808 nm, SHG a 522 nm, y THG a 348 nm. h) Una imagen de campo claro que valida los resultados obtenidos mediante microscopía híbrida; MC, células de melanoma. i) Imágenes FDOM a 488 nm que muestran vasculatura y células de melanoma. j) Una imagen FDOM a 808 nm que muestra células de melanoma B16F10 inyectadas en la oreja del ratón. k) Una imagen de SHG que muestra la distribución del colágeno en la epidermis. l) Una imagen THG que muestra la morfología del tejido; predominantemente queratinocitos y folículos pilosos. Crédito: Luz:ciencia y aplicaciones . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Para imágenes de tejidos in vivo basadas en FDOM, los científicos observaron la oreja de un ratón anestesiado. Obtuvieron imágenes sin artefactos con múltiples frecuencias de modulación que coincidían con las frecuencias espaciales del objeto fotografiado. Los científicos utilizaron un máximo de nueve frecuencias en el estudio. La SNR de la imagen aumentó de ~ 14 dB en una sola frecuencia a ~ 30 dB en nueve frecuencias para obtener imágenes más nítidas.
Luego observaron una oreja de ratón que contenía células de melanoma metastásico murino in vivo como antes mediante la excitación sincronizada de dos longitudes de onda (488 nm y 808 nm) a frecuencias de modulación separadas. Utilizando microscopía óptica y optoacústica combinada, Kellnberger y sus colaboradores pudieron obtener imágenes de manera eficiente de las características del tejido (es decir, vasculatura, células de melanoma, colágeno y queratinocitos) sin etiquetas o marcadores fluorescentes convencionales.
Kellnberger y col. luego realizó mediciones de FD micro-Doppler (µDoppler) con la configuración por primera vez en una oreja de ratón para obtener imágenes optoacústicas del flujo sanguíneo microcirculatorio in vivo. Antes de realizar las mediciones previstas, Los científicos utilizaron partículas de carbón negro a diferentes velocidades de flujo de circulación en un chip de microfluidos para validar la configuración experimental. Posteriormente, se empleó el µDoppler FDOM para generar un mapa de microcirculación en la oreja de un ratón. El flujo sanguíneo microcirculatorio reveló una velocidad que aumentaba gradualmente desde el borde del vaso hasta el núcleo.
Imágenes optoacústicas del flujo sanguíneo microcirculatorio en una oreja de ratón in vivo. a Un esquema de la configuración de detección µDoppler. FL1− flujo 1 lejos del sensor de EE. UU., FL2− flujo 2 lejos del sensor de EE. UU. (FL2−
De este modo, el estudio demostró el uso de la detección y demodulación de señales basadas en microscopía optoacústica de dominio de frecuencia (FDOM) por primera vez. Los científicos capturaron señales de amplitud y fase en múltiples frecuencias del objeto de la imagen. La configuración experimental colectiva contenía fuentes de luz económicas, iluminación simultánea de múltiples longitudes de onda y mediciones de flujo directas basadas en Doppler. En estudios futuros, Kellnberger y col. cuantificará las frecuencias de modulación, la profundidad de la imagen y aumente la resolución de la imagen utilizando una configuración experimental mejorada.
© 2019 Science X Network
