PB430 consiste en un esqueleto conjugado de Ï € completamente condensado con una unidad de óxido P fosfo que acepta electrones, que es responsable de su alta fotoestabilidad. El ácido carboxílico de la molécula se puede convertir en el éster de N-hidroxilsuccinimidilo (NHS), que permite la conjugación a biomoléculas. Los grupos sulfonato aseguran una alta solubilidad de la molécula en agua. Crédito:ITbM, Universidad de Nagoya
Químicos en ITbM, La Universidad de Nagoya ha desarrollado un tinte fluorescente súper fotoestable llamado PhoxBright 430 (PB430) para visualizar la ultraestructura celular mediante microscopía de súper resolución. La fotoestabilidad excepcional de este nuevo tinte permite obtener imágenes STED continuas. Con su capacidad para etiquetar proteínas con etiquetas fluorescentes, PB430 demuestra su uso en la construcción tridimensional y la formación de imágenes multicolores de estructuras biológicas.
Microscopía de fluorescencia de superresolución, que recibió el Premio Nobel de Química 2014, permite a los investigadores visualizar sistemas biológicos y obtener una comprensión detallada de la dinámica compleja de las biomoléculas. En particular, La microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) se utiliza ampliamente para examinar procesos en sistemas vivos debido a su rápida velocidad de adquisición y compatibilidad con muchas muestras biológicas.
Los químicos del Instituto de Bio-Moléculas Transformativas (ITbM) de la Universidad de Nagoya han desarrollado un nuevo tinte fluorescente fotoestable, PhoxBright 430 (PB430), que permite obtener imágenes STED de superresolución continua de células marcadas con fluorescencia. Como PB430 contiene un resto funcional para permitir la conjugación con un anticuerpo, Las dianas de biomoléculas específicas dentro de una célula pueden teñirse mediante inmunofluorescencia. La fotoestabilidad excepcional de PB430 permitió a los investigadores construir una imagen STED 3-D de microtúbulos celulares y lograr imágenes STED multicolor de citoesqueletos inmunomarcados fluorescentes mediante la combinación de PB430 fotoestable y tintes disponibles comercialmente.
Las propiedades únicas de PB430 lo convierten en una herramienta poderosa para revelar las estructuras y funciones de las células, y podría aplicarse a la visualización prolongada del movimiento de orgánulos y moléculas dentro de las células. Los resultados de este estudio se informaron recientemente en el Revista de la Sociedad Química Estadounidense .
Para lograr una alta resolución en microscopía STED, una muestra biológica marcada con un fluoróforo (un tinte fluorescente que se utiliza para marcar muestras biológicas como proteínas, tejidos y células) se irradia con un haz de excitación de fluorescencia junto con un haz STED en forma de rosquilla para suprimir la excitación de las moléculas circundantes. Aunque es una técnica poderosa, la necesidad de un haz STED de alta intensidad, que provoca el fotoblanqueo de los tintes, ha inhibido el uso práctico de la microscopía STED en imágenes continuas de células vivas.
Los investigadores han informado previamente sobre un tinte fluorescente, C-Naphox, que exhibe una fuerte fotoestabilidad en imágenes STED. El grupo ahora ha optimizado la estructura de C-Naphox y ha desarrollado el nuevo tinte fluorescente fotoestable, que se puede utilizar para la visualización de estructuras dentro de las células.
PB430 muestra una fotoestabilidad excepcional en comparación con los tintes convencionales, como se muestra en el número de imágenes confocales que se pueden tomar sin perder su intensidad de fluorescencia relativa. El nuevo tinte también puede marcar proteínas, como anticuerpos y es capaz de escanear la célula a lo largo del eje z con un paso de 50 nm, resultando en la reconstrucción de la imagen 3D-STED del citoesqueleto con una resolución del eje z de 160 nm. Crédito:ITbM, Universidad de Nagoya
"C-Naphox ha demostrado ser un tinte extremadamente fotoestable para la formación de imágenes STED de varios materiales, así que decidimos ajustar aún más sus propiedades y aplicarlo para visualizar ultraestructuras, "dice Masayasu Taki, profesor asociado en ITbM y uno de los líderes de esta investigación. "Nuestro nuevo tinte, PB430 muestra una mayor solubilidad en agua, fluoresce eficientemente en medios acuosos, y es capaz de marcar anticuerpos. Nos complació observar que también exhibe una alta fotoestabilidad en condiciones STED, "dice Taki.
Chenguang Wang, investigador postdoctoral en el grupo de investigación del profesor Shigehiro Yamaguchi en ITbM, sintetizó PB430 y llevó a cabo los experimentos de imágenes STED. De manera similar a C-Naphox, el nuevo tinte fluorescente es estable al aire y consta de una estructura reforzada, anillo fusionado, esqueleto π-conjugado que contiene una unidad fosfo P-óxido, que es el origen del nombre PhoxBright. En lugar del resto de trifenilamina, PB430 tiene un grupo de ácido carboxílico que puede conjugarse con anticuerpos para inmunomarcación mediante la formación de un éster de N-hidroxilsuccinimidilo (NHS).
Los experimentos de imágenes STED de anticuerpos conjugados con PB430 en células HeLa fijadas condujeron a imágenes de fluorescencia de microtúbulos inmunomarcados, con solo un ligero fotoblanqueo. PB430 actuó como marcador fluorescente para proteínas y su intensidad de fluorescencia se mantuvo incluso cuando estaba conjugado.
"La alta fotoestabilidad del PB430 permite obtener imágenes de fluorescencia que no eran fácilmente posibles con los tintes convencionales, "explica Taki". Por ejemplo, PB430 se puede utilizar en imágenes 3-D-STED del citoesqueleto, porque puede soportar el haz STED continuo en el eje z después de obtener imágenes en el eje xy ".
Es más, el grupo demostró que el PB430 podría aplicarse a imágenes STED multicolor aprovechando la diferencia de fotoestabilidad entre varios tintes fluorescentes. Realizaron experimentos de imágenes STED de microtúbulos y vimentina (proteínas de filamento intermedio) del citoesqueleto, inmunomarcado con PB430 y Alexa Fluor 430 (un tinte fluorescente), respectivamente. Como Alexa Fluor 430 fotoblanquea después de tomar la primera imagen STED, la segunda imagen solo muestra microtúbulos marcados con PB430. Restar la primera imagen de la segunda imagen revela los filamentos de vimentina etiquetados con Alexa Fluor 430.
"Generalmente, Las imágenes STED multicolor requieren varios láseres de excitación y un solo rayo láser STED, pero en la combinación de Alexa Fluor 430 con PB430, solo necesitamos un par de láseres de excitación y STED, "explica Taki". Al usar PB430, Creemos que será posible realizar imágenes STED multicolor con una serie de combinaciones diferentes de varios tintes fluorescentes. El siguiente paso es mejorar la permeabilidad de la membrana celular del tinte para visualizar las funciones de muchas otras estructuras celulares, " él continúa.
"Nuestra investigación ha demostrado que la fuerte fotoestabilidad y compatibilidad fisiológica de PB430 permite la obtención de imágenes repetidas, así como la obtención de imágenes en 3-D y la obtención de imágenes multicolores de células mediante microscopía STED, ", dice Yamaguchi." Esperamos poder aplicar nuestro tinte fluorescente para obtener imágenes de células vivas prolongadas mediante microscopía STED y microscopía de una sola molécula, con el fin de examinar varios procesos biológicos ".
