La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica que fotocopía un fragmento de ADN en muchos fragmentos, exponencialmente muchos. El primer paso es en PCR es calentar el ADN para que se desnaturalice, o se derrita en cadenas simples. La estructura del ADN es como una escalera de cuerda en la que los peldaños son cuerdas con extremos magnéticos. Los imanes se conectan para formar los escalones, llamados pares de bases, y así se resisten a separarse. Cada fragmento de ADN se funde en hebras únicas a diferentes temperaturas. Entender cómo la estructura del ADN se mantiene unida por las partes individuales del ADN dará una idea de por qué los diferentes fragmentos de ADN se derriten a diferentes temperaturas y por qué se necesitan esas altas temperaturas en primer lugar.
¡Derretirse! ¡Fusión!
El primer paso de la PCR es derretir el ADN para que el ADN bicatenario se separe en ADN monocatenario. Para el ADN de mamíferos, este primer paso generalmente implica calor de aproximadamente 95 grados Celsius (aproximadamente 200 Fahrenheit). A esta temperatura, los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases A-T y G-C, o peldaños en la escalera de ADN, se rompen, descomprimiendo el ADN bicatenario. Sin embargo, la temperatura no es lo suficientemente alta como para romper la cadena principal de fosfato y azúcar que forma los hilos individuales o los polos de la escalera. La separación completa de hebras simples los prepara para el segundo paso de la PCR, que se está enfriando para permitir fragmentos cortos de ADN, llamados iniciadores, para unir las hebras únicas.
Cremalleras magnéticas
Una razón por la que el ADN es calentado a la temperatura alta de 95 grados Celsius es que cuanto más larga es la cadena doble de ADN, más quiere permanecer unida. La longitud del ADN es un factor que afecta el punto de fusión elegido para la PCR en esa parte del ADN. Los pares de bases A-T y G-C en el ADN bicatenario se unen entre sí para mantener unida la estructura de doble cadena. Cuantos más pares de bases consecutivos entre dos hebras únicas se hayan unido, más se querrán vincular sus vecinos y más fuerte será la atracción entre los dos filamentos. Es como una cremallera hecha de pequeños imanes. Al cerrar la cremallera, los imanes naturalmente querrán cerrar con cremallera y permanecer cerrados.
Los imanes más fuertes se adhieren más firmemente
Otro factor que afecta la temperatura de fusión para elegir el fragmento de su ADN de interés es la cantidad de pares de bases GC presentes en ese fragmento. Cada par de bases es como dos mini imanes que atraen. Un par hecho de G y C es mucho más atraído que un par A y T. Por lo tanto, un trozo de ADN que tenga más pares de G-C que otro fragmento requerirá una temperatura más alta antes de fundirse en cadenas simples. El ADN absorbe naturalmente la luz ultravioleta, a una longitud de onda de 260 nanómetros, para ser exactos, y el ADN monocatenario absorbe más luz que el ADN bicatenario. Entonces, medir la cantidad de luz absorbida es una forma de medir cuánto se ha derretido su ADN bicatenario en cadenas simples. El efecto de "cremallera magnética" de los pares de bases G-C y A-T es lo que hace que un gráfico de la absorbancia de luz del ADN bicatenario trazado frente a un aumento de la temperatura sea sigmoidal, con forma de S, y no una línea recta. La curva de S representa la resistencia del trabajo en equipo que los pares de bases ejercen contra el calor porque no quieren separarse.
The Halfway Point
La temperatura a la que se derrite una longitud de ADN en hebras simples se llama temperatura de fusión, que se denota con la abreviatura "Tm". Esto indica la temperatura a la cual la mitad del ADN en una solución se ha fundido en hebras únicas y la otra mitad aún está en forma de doble hebra. La temperatura de fusión es diferente para cada fragmento de ADN. El ADN de los mamíferos tiene un contenido de G-C del 40%, lo que significa que el 60% restante de los pares de bases son As y Ts. Su 40% de contenido de G-C hace que el ADN de los mamíferos se derrita a 87 grados Celsius (aproximadamente 189 Fahrenheit). Esta es la razón por la cual el primer paso de la PCR en el ADN de mamíferos es calentarlo a 94 grados Celsius (201 Fahrenheit). Solo siete grados más que la temperatura de fusión y todos los hilos dobles se fundirán por completo en hilos sueltos.
