Las células observadas en un portaobjetos colocados bajo un microscopio se cuentan utilizando una herramienta de laboratorio común conocida como hemacitómetro, o una cámara de recuento de células, junto con un tinte de exclusión llamado azul tripán. El colorante tiñe las células muertas de azul, pero no puede entrar en las células vivas, que aparecerán como esferas brillantes y blancas a través del ocular del microscopio. Los científicos necesitan contar células para colocar el número correcto de células en un medio de cultivo celular o reactivo experimental para cuantificación y análisis o simplemente para evitar que las células crezcan demasiado.
Determine el tipo de hemacitómetro (p. Ej., Neubauer) siendo utilizado. Estos son básicamente portaobjetos de microscopio gruesos que contienen un área central grabada con rejillas de conteo. Colóquelo bajo el microscopio con un aumento escaso (10-20X) y ajuste el enfoque de las lentes hasta que estén visibles las cuadrículas de conteo individuales.
Prepare una suspensión de células. Use la enzima tripsina para dividir el tejido en células individuales y luego neutralice la tripsina con suero. Lave y sedimente las células, y resuspenda en medio o solución salina. Elimine las acumulaciones de células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Si la suspensión parece turbia, diluya más con más solución salina.
Utilice el azul tripán para excluir las células muertas. Transfiera 10-20 microlitros de suspensión celular a un tubo estéril y mezcle con el mismo volumen exacto de colorante azul tripán pipeteando suavemente. Esto diluye la suspensión celular 1: 2 en azul tripán.
Prepare el hemactómetro. Limpie con etanol al 70%, seque al aire y luego coloque un cubreobjetos sobre las rejillas de conteo. En el \\ "drenaje \\" en la parte superior de cada cuadrícula, coloque 10 microlitros de suspensión de celda y permita que el \\ "drenaje \\" lo tire debajo del cubreobjetos. Repita para esta otra cuadrícula hasta que ambos tengan una capa uniforme de suspensión celular.
Cuente el número de celdas usando el contador manual. Las células vivas reflejarán la luz y aparecerán brillantes, blanquecinas y esféricas. Las células que son azules están muertas o dañadas y no deben contarse a menos que se necesiten números de células no viables. Repita para las 8 cuadrículas de conteo y luego tome el promedio. Por ejemplo, si 800 celdas se cuentan en 8 cuadrículas, entonces el promedio por cuadrícula es de 100 celdas.
Calcule la densidad celular en la suspensión original. Aplique el número promedio de células a la siguiente fórmula: Concentración celular = Número promedio de células Factor de dilución X 10,000 X (= 2, si la dilución es 1: 2) X volumen de suspensión (en mililitros, ajuste según sea necesario para microlitros, etc. ).
Limpia el hemacitómetro. Lave la suspensión celular, limpie el hemacitómetro con lejía y /o isopropanol al 70% o inunde con etanol al 70%. Deje secar o seque con un paño sin pelusa y deseche todas las suspensiones celulares no deseadas en contenedores de riesgo biológico.
Advertencia
El azul de tripano es un mutágeno y se mancha permanentemente, por lo tanto, asegúrese de que la ropa protectora y se usan guantes antes de continuar.
