(Phys.org) - Al cargar cualquier proteína y ácido nucleico específicos en una nanopartícula basada en la cápside del fago T4 icosaédrico, Los ligandos del vehículo de liberación celular resultante pueden unirse a la superficie de tejidos diana específicos para administrar la carga de proteína / ADN. (Las nanopartículas virales icosaédricas son capas de proteínas evolutivas ensambladas en un orden jerárquico que da como resultado una capa de proteína estable y un espacio interno para acomodar ácidos nucleicos y proteínas; una cápside es la capa de proteína de un virus). aplicaciones de administración en enfermedades humanas, diagnóstico y diagnóstico por imagen celular, y otras áreas médicas. Recientemente, científicos del Laboratorio de Investigación Naval de EE. UU. Washington, DC y la Universidad de Maryland en Baltimore empaquetaron nanopartículas de T4 en vivo con recombinación cíclica activa, o Cre, recombinasa (una enzima de recombinación genética utilizada para manipular la estructura del genoma y controlar la expresión génica) y in vitro con mCherry fluorescente (una proteína fluorescente utilizada como marcador cuando se etiqueta a moléculas y componentes celulares) expresión de ADN plasmídico, y entregó estas nanopartículas a las células cancerosas:cuando se liberan en las células en presencia de ADN y proteínas, la recombinasa mejora la expresión de mCherry por circularización (es decir, cambiando el ADN lineal empaquetado en un bucle circular). Los investigadores afirman que este empaquetado eficiente y específico en cápsidas y el desempaquetado tanto del ADN como de la proteína con la liberación de los complejos de proteína / ADN alterados enzimáticamente de las nanopartículas a las células tienen potencial en numerosas aplicaciones posteriores, como la terapéutica genética y del cáncer.

La Dra. Jinny L. Liu discutió el documento que ella, La profesora Lindsay W. Black y sus coautores publicaron en Actas de la Academia Nacional de Ciencias de EE. UU. . "Las nanopartículas virales icosaédricas son esencialmente nanocontenedores de 100 nm por 80 nm que permiten empaquetar material genético exógeno in vitro a través de la maquinaria de ácido nucleico que generalmente solo permite empaquetar ADN / ARN lineal a través de un canal portal, "Liu dice Phys.org . "Sin embargo, in vitro el envasado de proteínas es generalmente imposible, porque para la mayoría de las nanopartículas virales no existe una maquinaria de envasado de proteínas comparable a la maquinaria de envasado de ácidos nucleicos ". se espera que esto conduzca a la desnaturalización de las proteínas y a la pérdida de actividad enzimática.

Habiendo dicho eso, la naturaleza ha desarrollado soluciones para este enigma del empaquetado de proteínas. Durante en vivo montaje de la cápside viral, Liu explica, algunos virus bacterianos, o bacteriófagos, proteínas diana dentro de las procápsidas antes de el ácido nucleico está empaquetado para expulsar las proteínas con el ácido nucleico, facilitando así la infección junto con el ácido nucleico. (Un procapsid, o prohead, es una estructura de cápside viral inmadura formada en las primeras etapas del autoensamblaje de algunos bacteriófagos. La producción y el ensamblaje de proheads estables es un precursor esencial para el empaquetamiento del genoma de bacteriófagos.) Solo unos pocos fagos se han caracterizado bien en vivo sistemas de envasado de proteínas, y el fago T4 es el mejor caracterizado. "El laboratorio del Prof. Black en la UMB y mi laboratorio en el NRL han demostrado que no solo se puede empaquetar una enzima extraña específica, la recombinasa de recombinación cíclica (Cre), en la cápside en vivo , pero también que es activo dentro de la cápside ". Esta actividad se demostró mostrando la religación (la unión de dos cadenas de ADN u otras moléculas por un enlace éster fosfato) del ADN lineal empaquetado flanqueado por dos sitios de recombinación Cre.

El documento muestra que el espacio sustancial dentro de un nanocontenedor de T4 aloja la enzima Cre activa junto con el ADN exógeno. "Para posibles aplicaciones, T4 puede empaquetar hasta 50 kb de ADN lineal exógeno que contiene genes deseados de longitud completa junto con recombinasas, ya sea Cre o proteínas λ-red, para la recombinación homóloga específica dentro del cromosoma, "Observa Liu. ( Recombinación homóloga es un tipo de recombinación genética en la que las secuencias de nucleótidos se intercambian entre dos moléculas de ADN similares o idénticas). "Esperamos que la enzima cas9 pueda encapsidarse de una manera comparable, y de hecho, de esta manera se han encapsidado al menos ocho proteínas diferentes. Mediante recombinación homóloga, nuestro sistema puede permitir que el gen corregido reemplace el gen mutado en su ubicación original dentro del cromosoma o eliminando con precisión los genes hiperactivos en las células madre ". Liu señala que el vector de administración de T4 es más seguro y está mejor controlado que otros genes de administración viral terapia, como los que administran genes que utilizan vectores virales animales infecciosos para insertar aleatoriamente el gen dentro del cromosoma.

En su papel los autores informan que la expresión del gen NP de la cápside T4 y el sistema de suministro de proteínas pueden ser complementarios o usarse junto con la terapia génica basada en ARN Cas y taran nucleasa. (Los genes Cas codifican proteínas relacionadas con loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases conocidas como repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas, o CRISPRs.) "El sistema de expresión de nanopartículas T4 puede complementar fácilmente la recombinación basada en nucleasa de taran y Cas9 al empaquetar el cas9 lineal, ADN plasmídico de ARNg objetivo, y Cre recombinasa - o incluso ligasa, una enzima que facilita la unión de cadenas de ADN y entrega las nanopartículas de T4 resultantes a las células eucariotas receptoras con alta especificidad empleando SOC y HOC, "Liu dice Phys.org . (SOC y HOC son proteínas de la cápside T4 prescindibles). "Al mostrar los ligandos de dirección (moléculas de unión) en la superficie, la expresión génica de la cápside T4 y el sistema de proteínas podrán administrar de manera eficiente los plásmidos Cas9 y sgRNA juntos en las células receptoras deseadas. Proteínas enzimáticamente activas relevantes Cas9, exonucleasa lambda, La proteína lambda beta y otras se pueden administrar directamente al mismo tiempo desde la nanopartícula T4 ".

Liu agrega que su laboratorio también ha estado estudiando imágenes de células y administración de fármacos / genes a células eucariotas utilizando nanopartículas T4 sin cola. que los investigadores demostraron que puede ingresar a las células eucariotas sin causar la muerte celular.

Un ejemplo específico de posibles aplicaciones terapéuticas de fármacos y genes posteriores que resultan del nuevo enfoque es la administración de la proteína tóxica y el plásmido lineal que produce péptidos o anticuerpos neutralizantes en células cancerosas diana que muestran marcadores de cáncer específicos utilizando proteínas de unión de marcador SOC + HOC de alta afinidad en el superficie de las cápsides, mientras que otro ejemplo es utilizar el sistema para la terapia génica del VIH.

Liu agrega que existen varias vías para usar este sistema para la terapia génica:

• Entrega de nanopartículas de T4 empaquetadas con la recombinasa (o ligasa) y el ADN plasmídico lineal para producir gp120 o interferón para generar o estimular la respuesta inmune en los pacientes.
• Entrega de nanopartículas de T4 empaquetadas con recombinasa (ligasa) y el ADN plasmídico de expresión de CD40 soluble lineal en linfocitos T o células hematopoyéticas para bloquear la infección del VIH-1
• Inhibir el ARN mediante la entrega del ADN plasmídico diseñado que puede producir ARN señuelo para unirse al ADN de sentido viral.
• Inhibir la proteína mediante la entrega de anticuerpos anti-virales empaquetados y ADN plasmídico de anticuerpos anti-VIH.

Además del diagnóstico y las imágenes celulares, El sistema genético-proteico de nanopartículas T4 puede entregar genes reparados para corregir enfermedades genéticas humanas, por ejemplo, revertir la deficiencia de adenosina desaminasa (ADA) mediante la introducción del complejo proteína-ADN para expresar ADA en las células madre. Otras amplias áreas de investigación afectadas por las tecnologías de terapia génica, como defectos genéticos, cáncer, enfermedades neurológicas en adultos, y envejecer, también puede beneficiarse de este estudio.

Avanzando Los científicos quieren desarrollar más exonucleasa de empaquetamiento de procapsidas T4 y otras recombinasas junto con ADN diana diseñado para demostrar que las cápsides T4 resultantes pueden insertar el gen en una línea de células madre con una deficiencia genética. "Además, "Liu concluye, "Estamos trabajando para adaptar nuestro sistema para administrar péptidos terapéuticos o anticuerpos a las células expuestas o infectadas por agentes biológicos, como toxinas proteicas o virus, neutralización eficaz de los efectos de las toxinas. El tratamiento y la curación de células y tejidos expuestos a tales agentes son de gran interés para nuestra comunidad de investigación en biodefensa ".

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