La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica de laboratorio utilizada para separar e identificar compuestos. Es un tipo de cromatografía en columna que depende de las diferentes polaridades de los compuestos en una solución para separarlos. HPLC difiere de la cromatografía en columna estándar porque utiliza presión para forzar la solución a través de la columna más rápidamente y, por lo tanto, produce resultados más rápidos y, a veces, más precisos. El objetivo es separar compuestos en la columna y hacer que salgan por separado.

Coelution

Debido a la velocidad de HPLC y su dependencia de diferentes polaridades de compuestos, dos compuestos con estructura y polaridades similares puede salir del aparato de cromatografía al mismo tiempo o casi al mismo tiempo. Esto se conoce como coelución. La coelución hace que determinar exactamente qué parte de la mezcla se eluye en qué punto sea difícil.

Compuestos adsorbidos

HPLC generalmente utiliza una columna de vidrio llena de cuentas hechas de diferentes materiales. Las mezclas que se fuerzan a través de la columna tienen sustancias químicas que se unen con diferentes resistencias a las perlas. La fuerza de la unión, que depende de la similitud en la polaridad, determina cuánto tiempo se unirá la sustancia química al cordón antes de ser liberada. Algunos compuestos se unen tan fuertemente que en esencia nunca se liberan de las perlas en la columna y nunca se miden en la solución que sale de la columna.

Costo

Las técnicas de separación de laboratorio típicas implican desarrollar un ensayo, o método de separación, y luego implementar ese ensayo para separar los compuestos individuales de una solución. Sin embargo, esto generalmente resulta en soluciones múltiples que también necesitan someterse a procedimientos, lo que lleva a un aumento exponencial en la complejidad. Aunque la HPLC a menudo puede simplificar y acelerar este proceso, el costo de desarrollar un aparato de HPLC puede ser tremendo. Desarrollar un aparato de HPLC, aunque mucho más eficiente, es mucho más costoso que desarrollar otros ensayos para separar compuestos. Esto hace que no sea financieramente viable para muchos pequeños laboratorios de propiedad privada.

Complejidad

HPLC no solo se usa para separar compuestos simples, sino que también se usa para aislar proteínas específicas de una mezcla celular. En este caso, las cuentas en la columna usualmente están recubiertas con un anticuerpo específico para la proteína que necesita recolectar. Las proteínas se unen a los anticuerpos y la solución restante se pasa a través de la columna, luego las proteínas se liberan usando otra solución y se recogen. Esto requiere un técnico altamente calificado para monitorear la columna en todo momento y asegurarse de que el proceso se ejecute exactamente como se planeó.