El diagnóstico molecular juega un papel cada vez más importante en la medicina para la detección de enfermedades genéticas, el seguimiento de la eficacia de la terapia contra el cáncer, y en la lucha contra las infecciones bacterianas agresivas. Diagnóstico de curiosidad (CD), una empresa perteneciente al grupo Scope Fluidics, ha desarrollado una nueva técnica para el análisis de ADN:PCR sinérgica (sPCR). El método, descrito en detalle en la publicación conjunta de los investigadores de CD e IPC PAS en Informes científicos combina las ventajas de dos de las técnicas de análisis de código genético más populares de la actualidad y puede llevarse a cabo en instrumentos ampliamente disponibles.

"La técnica de análisis de ADN que proponemos nació durante el desarrollo del innovador instrumento analítico PCR | ONE, que se puede utilizar para probar el código genético en solo siete minutos. Este es un tiempo diez veces más corto que el requerido en las soluciones clásicas, "dice el profesor Piotr Garstecki (IPC PAS, CD).

Las muestras enviadas para los ensayos de ADN suelen contener tan poco material genético que no sería posible su análisis mediante técnicas de laboratorio convencionales. Después de eliminar las impurezas de la muestra, el primer paso es aumentar la cantidad de material genético, a menudo hasta mil millones de veces. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para este propósito.

La reacción de PCR implica el calentamiento y enfriamiento cíclicos de una solución que contiene el material genético amplificado y los reactivos apropiados:una polimerasa (es decir, la enzima que cataliza la reacción de síntesis de ADN), los nucleótidos necesarios para construir la cadena de ADN, y cebadores, es decir., fragmentos cortos de ADN capaces de adherirse al principio y al final del fragmento de código propagado (p. ej., un gen específico). Cada ciclo de PCR consta de fases de calentamiento y enfriamiento. En la primera fase, a una temperatura de unos 95 grados centígrados, los puentes de hidrógeno se rompen, y la cadena de ADN, hasta ahora de doble hebra, se divide en dos hebras simples. En la fase fría, a una temperatura de unos 50 grados, los cebadores de la solución se adhieren a los sitios correspondientes en los hilos, después de lo cual la polimerasa construye un hilo complementario entre ellos. Al final de cada ciclo, hay (en condiciones ideales) el doble de fragmentos de ADN bicatenario que al principio.

La PCR se utiliza para detectar fragmentos específicos del código genético y estimar la cantidad original de material genético. Las mediciones cuantitativas se suelen realizar mediante una técnica analógica conocida como PCR en tiempo real. La muestra se propaga, y en ciclos posteriores, la cantidad de ADN se comprueba con tintes fluorescentes. Cuando la intensidad de los cambios excede un umbral establecido, la cantidad original de material genético se estima en función del número de ciclos. La técnica de PCR analógica es relativamente sencilla, pero debido a la sensibilidad de la PCR incluso a partículas individuales de impurezas, requiere cuidado, calibración continua.

Otro método es la PCR digital. La muestra se divide en decenas o cientos de miles, ya veces incluso millones de particiones de igual volumen. Luego, en cada partición, Se realiza el procedimiento de duplicación de material genético y se verifica si aparece el cambio de conjunto. Durante la división de la muestra de ADN, las moléculas solo alcanzan algunas particiones, por lo que el cambio no ocurre en todas partes. Por tanto, la cantidad original de ADN puede estimarse basándose en el número de señales registradas. La ventaja de la tecnología digital es que no es necesario calibrar el dispositivo. Sin embargo, debido a la necesidad de realizar una gran cantidad de reacciones en paralelo, el equipo de prueba es caro y no es tan común en los laboratorios como los aparatos de PCR analógicos.

PCR sinérgica, la técnica propuesta por CD e IPC PAS, combina las ventajas más importantes de los métodos analógico y digital. Para obtener medidas fiables, basta con diluir una muestra en solo una docena, o como máximo varias docenas de particiones. Este método no requiere calibración.

"Un pequeño número de particiones, característica de nuestra técnica, tiene un significado práctico específico. Significa que para realizar el análisis, todo lo que se necesita es el formato de placa de pocillos estándar utilizado en los dispositivos de PCR analógicos populares, "dice Pawel Debski, un estudiante de doctorado IPC PAS, quien desarrolló el método sPCR en Curiosity Diagnostics.

Debido a una pequeña cantidad de particiones de muestra, la técnica sPCR es más fácil de realizar y ligeramente más rápida que las variantes digitales. En comparación con las técnicas analógicas, sin embargo, se requieren más reactivos. Por esta razón, no sustituirá a la variante analógica, según los científicos. Sin embargo, puede ser una adición valiosa porque no necesita calibración, permitiendo así al personal de laboratorio comprobar la exactitud de las medidas analógicas de forma independiente.

"Nuestra técnica de prueba de ADN ha sido patentada. Sin embargo, queremos enfatizar la libertad de usarlo con fines no comerciales. Y como usa típico, equipo de pruebas genéticas popular, todo lo que necesita hacer para comenzar es buscar nuestro artículo, "destaca el Prof. Garstecki.

En máquinas de PCR estándar, Se utiliza una difusión de calor relativamente lenta entre la muestra y un gran bloque adyacente de material calentado o enfriado alternativamente para calentar y enfriar el material genético. En PCR | ONE, Se utiliza radiación infrarroja para calentar la muestra rápidamente. También se ha modificado el mecanismo de enfriamiento por difusión:el bloque utilizado para este fin es más pequeño que en los instrumentos convencionales y se mantiene constante, temperatura estrictamente controlada. Como resultado de las mejoras técnicas y analíticas, los prototipos de PCR | ONE pueden completar ensayos de ADN en menos de un cuarto de hora, y el PCR en sí solo toma siete minutos. Lo más probable es que los primeros dispositivos PCR | ONE lleguen al mercado en dos o tres años.