Actualmente es un desafío observar directamente la formación de nanoestructuras intracelulares en el laboratorio. En un nuevo informe, Miaomiao Zhang y un equipo de investigación en química, Ciencias de la vida, ingeniería médica y ciencia y tecnología, en China, utilizó una molécula pequeña de diseño racional abreviado NBC-Iod-CBT (abreviatura de carbamato de 4-nitrobencilo-Cys (SEt) -Asp-Asp-Phe (yodo) -2-ciano-benzotiazol) y observó directamente la formación de nanopartículas intracelulares con tomografía nanocomputada ( nano-CT).

Durante los experimentos, Los mecanismos de reducción de glutatión (GSH) y de escisión de nitrorreductasa (NTR) hicieron que las moléculas de NBC-Iod-CBT sufrieran una reacción de condensación de clic y nanopartículas (NP) autoensambladas como Iod-CBT-NP. Cuando el equipo realizó imágenes de nano-CT de NBC-Iod-CBT tratado, células HeLa que expresan nitrorreductasa en el laboratorio, demostraron la existencia de Iod-CBT-NPs autoensamblados en su citoplasma. La nueva estrategia ahora se publica en Avances de la ciencia y ayudará a los científicos biológicos y bioingenieros a comprender los mecanismos de formación de nanoestructuras intracelulares.

Una estrategia inteligente para el nanoensamblaje

El ensamblaje de nanoestructuras utilizando pequeños precursores moleculares dentro de las células es una estrategia inteligente con grandes ventajas en la obtención de imágenes moleculares y la administración de fármacos. Las células pueden absorber moléculas pequeñas fácilmente, pero también se eliminan rápidamente. A diferencia de, las nanoestructuras con agentes terapéuticos tienen períodos de retención más largos en las células con mayor potencia. Sin embargo, Es mucho más difícil para una célula adoptar una nanoestructura en comparación con una molécula pequeña. Por lo tanto, los científicos activan nanoestructuras para la absorción celular modificando la superficie celular con ojivas dirigidas, 'pero tales modificaciones pueden reducir la reproducibilidad del nanocomplejo. Como resultado, un método inteligente desarrollado recientemente tiene como objetivo formar nanopartículas intracelulares, donde los cultivos celulares incubados con un precursor molecular pequeño tendrán una nanoestructura en ellos, para aplicaciones interesantes en imágenes moleculares y administración de fármacos. Sin embargo, Todavía es difícil diferenciar entre las nanoestructuras formadas artificialmente y las estructuras celulares intrínsecas. Para lograr esto, Zhang y col. primero diseñó un precursor de molécula pequeña que contiene yodo (yodo), luego sometieron el compuesto a un autoensamblaje intracelular instruido por enzimas para formar las nanopartículas de interés y utilizaron nano-CT (tomografía nanocomputada) para observar las nanopartículas intracelulares.

La estructura molecular pequeña NBC-Iod-CBT yodada tenía un diseño racional constituido por cuatro partes, que incluía

1. Un sustrato de carbamato de 4-nitrobenxilo (NBC) para descomponer la nitroreductasa (NTR),
2. Un motivo de cisteína latente (Cys) y estructuras de 2-ciano-benzotiazol (CBT) para reacciones de condensación de clic CBT-Cys,
3. Una región yodada para la mejora del contraste de la tomografía computarizada, y
4. Dos motivos de ácido aspártico hidrófilo para una buena solubilidad en agua en condiciones fisiológicas

Cuando el compuesto entró en las células cancerosas hipóxicas (privadas de niveles adecuados de oxígeno) que sobreexpresan nitroreductasa (NTR), se sometieron a un autoensamblaje para formar nanopartículas (NP) conocidas como Iod-CBT-NPs. Para inducir la formación de nanopartículas activadas por nitroreductasa (NTR) en el laboratorio, Los científicos incubaron la molécula pequeña NBC-Iod-CBT con soluciones salinas tamponadas y agregaron la solución de nitroreductasa durante dos horas para formar nanoestructuras con absorbancias visibles entre 500 y 700 nm.

Cuando Zhang et al. agregó un inhibidor de nitroreductasa conocido como dicumarina a la solución, las absorbancias visibles de las mezclas disminuyeron, confirmando la formación de nanoestructuras en presencia de nitroreductasa. Usando imágenes de microscopía electrónica de transmisión, El equipo observó la aparición de nanopartículas y utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas de ionización / desorción láser asistida por matriz de alta resolución para confirmar la formación de Iod-CBT-NP. Zhang y col. a partir de entonces utilizó imágenes de nano-CT tridimensionales (3-D) de la mezcla con una nano-CT de microscopía de rayos X suave para finalmente reconstruir las imágenes de nano-CT en 3-D, donde diferentes componentes del compuesto mostraron diferentes capacidades de absorción de rayos X. De este modo, el experimento facilitó que el compuesto de interés NBC-Iod-CBT se sometiera a un autoensamblaje activado por NTR para formar las nanopartículas esperadas (Iod-CBT-NP) en el laboratorio.

Formación intracelular de Iod-CBT-NPs e imágenes de nano-CT de microscopía de rayos X blandos

Zhang y col. Luego investigó el mismo proceso experimental para inducir el autoensamblaje de nanopartículas dentro de las células. El compuesto de interés (NBC-Iod-CBT) tuvo una mayor selectividad hacia la nitroreductasa, para evitar así posibles interferencias intracelulares en presencia de otros constituyentes intracelulares como los biotioles, oxidantes y aminoácidos. Las células cancerosas HeLa de cuello uterino humano típicamente sobreexpresan nitrorreductasa (NTR) en condiciones hipóxicas (privadas de niveles adecuados de oxígeno), alcanzando los niveles experimentales más altos en ocho horas. Cuando Zhang et al. células HeLa hipóxicas incubadas con la molécula pequeña NBC-Iod-CBT, observaron la eventual formación de nanopartículas dentro de las células HeLa hipóxicas. Usando imágenes de microscopía electrónica de las células, demostraron la existencia de las nanopartículas como se esperaba en el citoplasma celular.

Para observar directamente las nanopartículas de interés (Iod-CBT-NP) dentro de las células, El equipo trató experimentalmente las células HeLa hipóxicas y las fotografió usando nano-CT de microscopía de rayos X suave. Luego utilizaron células HeLa hipóxicas pretratadas con dicumarina o normoxia (niveles normales de oxígeno) como dos controles positivos y células HeLa de hipoxia o normoxia sin tratar como dos controles negativos. Los resultados indicaron la formación de nanopartículas de Iod-CBT en el citoplasma de células HeLa hipóxicas. Cuando sometieron estas células a un tratamiento con inhibidor de nitroreductasa, el contraste CT del citoplasma disminuyó. El equipo reconstruyó proyecciones 2-D de las células para obtener imágenes nanoCT 3-D. Usando el coeficiente de absorción lineal (LAC) o el coeficiente de atenuación lineal, Zhang y col. confirmó la viabilidad de la formación de nanopartículas intracelulares.

De este modo, Miaomiao Zhang y sus colegas diseñaron racionalmente una construcción de NBC-Iod-CBT de molécula pequeña yodada para formar y observar directamente nanopartículas dentro de las células utilizando nano-CT. Después de experimentos de primera mano realizados in vitro, El equipo llevó a cabo más estudios en el citoplasma de las células HeLa que expresan nitroreductasa. Usando técnicas analíticas, El equipo mostró la formación de nanopartículas (Iod-CBT-NP) en las células HeLa hipóxicas tratadas con NBC-Iod-CBT de molécula pequeña. Verificaron su método utilizando el coeficiente de absorción lineal y confirmaron la viabilidad de la formación de nanopartículas intracelulares. Este trabajo ayudará a los investigadores a obtener conocimientos más profundos sobre la formación de nanoestructuras intracelulares con aplicaciones significativas en nanomedicina y bioingeniería.

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