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    Preparación de protocolos para la fabricación de biomoléculas deuteradas.

    Crédito:SINE2020

    Las técnicas de neutrones son buenas para estudiar átomos ligeros como el hidrógeno, ideales para moléculas biológicas que contienen un gran número de ellos. Los neutrones son particularmente sensibles a la sustitución isotópica de hidrógeno (1H) por deuterio (2H) y esto permite utilizar técnicas de contraste para estudiar moléculas en detalle. Para esto, los usuarios necesitan preparar versiones deuteradas de las moléculas biológicas que quieren estudiar. Sin embargo, estas moléculas per-deuteradas rara vez están disponibles en proveedores comerciales porque el mercado para ellas es de valor limitado. Aquí SINE2020 tiene como objetivo llenar el vacío.

    La Tarea 5.2 del paquete de trabajo de Deuteración Química es configurar los procedimientos para la extracción, purificación y análisis de biomoléculas pequeñas deuteradas. Estas moléculas estarán disponibles para los usuarios de técnicas de neutrones y a través de los socios de la plataforma DEUNET. Las principales biomoléculas involucradas son los fosfolípidos, esteroles (por ejemplo, colesterol) y esfingolípidos:todo tipo de moléculas que se pueden encontrar en las membranas biológicas y, por lo tanto, tienen aplicaciones importantes en productos farmacéuticos. Los lípidos también tienen funciones en los cosméticos, sectores de la alimentación y la nanotecnología, por lo que la capacidad de estudiarlos utilizando neutrones sería invaluable para muchos investigadores y empresas industriales.

    Krishna Batchu, con Giovanna Fragneto, en ILL está llevando a cabo la investigación para SINE2020. El trabajo se ha concentrado en varios fosfolípidos que incluyen principalmente fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC) y fosfatidilserina (PS). Se preparan utilizando cultivos celulares de la cepa de levadura Pichia pastoris, ya que funciona bien para la extracción de lípidos y crece con éxito en medios deuterados.

    Los fosfolípidos son moléculas anfipáticas que consisten en un grupo de cabezas amantes del agua y dos "piernas" que odian el agua. Las "patas" son cadenas de átomos de carbono unidos a hidrógeno (o átomos de deuterio). Sus composiciones en las membranas celulares son enormemente complejas con membranas que típicamente comprenden varios miles de especies moleculares de lípidos químicamente distintas. Las cadenas dentro pueden variar en longitud, generalmente entre 6 y 24 átomos de carbono, y contienen entre 0 y 12 dobles enlaces entre los átomos de carbono, el llamado nivel de saturación. Cuanto más dobles enlaces, cuanto más insaturada es la cadena.

    La homeostasis de los fosfolípidos en un sistema biológico se mantiene a través de tres procesos celulares clave:1) Biosíntesis, 2) Remodelación y 3) Degradación. En las células de levadura (en el cultivo) existe una maquinaria molecular dedicada al metabolismo de los ácidos grasos que provoca tanto el alargamiento como la insaturación de la cadena. catalizado por elongasas y desaturasas respectivamente, durante el proceso de producción. Una vez biosintetizado, su incorporación en varios fosfolípidos es catalizada por una serie de aciltransferasas, lo que conduce a la existencia de un repertorio más amplio de especies moleculares individuales. El desafío es que con tantas variables, la cantidad de tipos de fosfolípidos producidos es enorme.

    Parte del proyecto ha estudiado cómo las condiciones de crecimiento afectan el tipo de lípidos producidos. No se han encontrado diferencias significativas que sugieran que el tiempo de recolección afecte el perfil de lípidos, pero hay algunos indicios de que la fuente de carbono tiene un efecto y que se produce más insaturación si el crecimiento se produce a temperaturas más bajas.

    Una vez que ha crecido un cultivo celular, los lípidos necesitan ser extraídos, separados y purificados. Esto se ha logrado, tanto para PC hidrogenada como deuterada, Moléculas de PS y PE, utilizando un proceso de dos pasos:una extracción en fase sólida seguida de purificación a través de una columna de fase normal acoplada a un sistema de HPLC. Se han preparado versiones hidrogenadas para compararlas con las especies deuteradas y para los procesos de prueba iniciales para evitar el derroche de deuterio caro.

    Ahora el desafío es purificar especies moleculares individuales, identificarlos y analizarlos utilizando un enfoque de espectrometría de masas. El objetivo final es documentar cuidadosamente todos los procedimientos y protocolos para producir estas biomoléculas deuteradas para futuros usuarios.


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